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La crescita microbica nelle ferite si manifesta spesso come biofilm, che interferiscono con la guarigione e sono difficili da sradicare. Nuove medicazioni d'argento affermano di combattere le infezioni della ferita, ma l'efficacia anti-antibiofilm e gli effetti di guarigione indipendenti dalle infezioni sono generalmente sconosciuti. Usando modelli di biofilm in vitro e in vivo di stafilococco aureus e pseudomonas aeruginosa, riportiamo l'efficacia delle medicazioni che generano ioni Ag1+; Ag1+ medicazioni contenenti acido etilendiaminetetraacetico e cloruro di benzethonium (Ag1+/EDTA/BC) e medicazioni contenenti nitrati argento (Oxysalts AG). , che producono ioni Ag1+, Ag2+ e Ag3+ per combattere il biofilm della ferita e il suo effetto sulla guarigione. Le medicazioni Ag1+ hanno avuto effetti minimi sul biofilm della ferita in vitro e nei topi (C57BL/6J). Al contrario, i sali di Ag ossigenato e le medicazioni AG1+/EDTA/BC hanno ridotto significativamente il numero di batteri vitali nei biofilm in vitro e hanno dimostrato una riduzione significativa dei componenti batterici ed EPS nei biofilm per ferite di topo. Questi condimenti hanno avuto effetti diversi sulla guarigione di ferite infette dal biofilm e non-biofilm, con medicazioni sale ossigenate che hanno più effetti benefici sulla reepitelializzazione, le dimensioni della ferita e l'infiammazione rispetto ai trattamenti di controllo e ad altri condimenti argentati. Le diverse proprietà fisico-chimiche delle medicazioni d'argento possono avere effetti diversi sul biofilm e sulla guarigione della ferita, e questo dovrebbe essere preso in considerazione quando si seleziona una medicazione per il trattamento delle ferite infette dal biofilm.
Le ferite croniche sono definite come "ferite che non riescono a progredire attraverso le normali fasi della guarigione in modo ordinato e tempestivo" 1. Le ferite croniche creano un onere psicologico, sociale ed economico per i pazienti e il sistema sanitario. La spesa annuale del SSN per il trattamento delle ferite e le comorbidità associate è stimata in £ 8,3 miliardi nel 2017-182. Le ferite croniche sono attualmente anche un problema urgente negli Stati Uniti, con Medicare che stima il costo annuale del trattamento dei pazienti con ferite a $ 28,1- $ 96,8 miliardi3.
L'infezione è un fattore importante che impedisce la guarigione delle ferite. Le infezioni si manifestano spesso come biofilm, che sono presenti nel 78% delle ferite croniche non guarite. I biofilm si formano quando i microrganismi diventano irreversibilmente attaccati alle superfici, come le superfici delle ferite, e possono aggregarsi per formare comunità extracellulari (EPS). Il biofilm della ferita è associato ad un aumento della risposta infiammatoria che porta al danno tissutale, che può ritardare o prevenire la guarigione4. L'aumento del danno tissutale può essere dovuto in parte all'aumento dell'attività delle metalloproteinasi della matrice, della collagenasi, dell'elastasi e delle specie reattive dell'ossigeno5. Inoltre, le cellule infiammatorie e i biofilm sono essi stessi alti consumatori di ossigeno e possono quindi causare ipossia del tessuto locale, esaurimento delle cellule dell'ossigeno vitale necessario per un'efficace riparazione dei tessuti6.
I biofilm maturi sono altamente resistenti agli agenti antimicrobici, che richiedono strategie aggressive per controllare le infezioni da biofilm, come il trattamento meccanico seguito da un efficace trattamento antimicrobico. Poiché i biofilm possono rapidamente rigenerare, gli antimicrobici efficaci possono ridurre il rischio di riformazione dopo debridement chirurgico7.
L'argento è sempre più usato in medicazioni antimicrobiche ed è spesso usato come trattamento di prima linea per ferite da infette croniche. Esistono molte medicazioni in argento disponibili in commercio, ognuna contenente una diversa composizione d'argento, concentrazione e matrice di base. I progressi nei braccialetti d'argento hanno portato allo sviluppo di nuovi bracciali d'argento. La forma metallica di argento (AG0) è inerte; Per raggiungere l'efficacia antimicrobica, deve perdere un elettrone per formare argento ionico (Ag1+). Le medicazioni argento tradizionali contengono composti d'argento o argento metallico che, se esposti a liquidi, si decompongono per formare ioni Ag1+. Questi ioni Ag1+ reagiscono con la cellula batterica, rimuovendo gli elettroni da componenti strutturali o processi critici necessari per la sopravvivenza. La tecnologia brevettata ha portato allo sviluppo di un nuovo composto d'argento, Oxysalts AG (nitrato d'argento, Ag7No11), che è incluso nelle medicazioni per ferite. A differenza dell'argento tradizionale, la decomposizione dei sali contenenti ossigeno produce stati d'argento con maggiore valenza (Ag1+, Ag2+e Ag3+). Studi in vitro hanno dimostrato che basse concentrazioni di sali d'argento ossigenato sono più efficaci dell'argento a singolo ionico (Ag1+) contro i batteri patogeni come Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Escherichia coli8,9. Un altro nuovo tipo di medicazione in argento comprende ingredienti aggiuntivi, vale a dire l'acido etilendiaminetetraacetico (EDTA) e il cloruro di benzethonium (BC), che sono riportati per colpire Biofilm EPS e quindi aumentare la penetrazione dell'argento nel biofilm. Queste nuove tecnologie d'argento offrono nuovi modi per colpire biofilm per ferite. Tuttavia, l'impatto di questi antimicrobici sull'ambiente della ferita e sulla guarigione indipendente dalle infezioni è importante per garantire che non creino un ambiente ferita sfavorevole o ritardi la guarigione. Sono state riportate preoccupazioni sulla citotossicità in argento in vitro con diverse medicazioni d'argento10,11. Tuttavia, la citotossicità in vitro non si è ancora tradotta in tossicità in vivo e diverse medicazioni AG1+ hanno dimostrato un buon profilo di sicurezza12.
Qui, abbiamo studiato l'efficacia delle medicazioni carbossimetilcellulose contenenti nuove formulazioni d'argento contro il biofilm ferita in vitro e in vivo. Inoltre, sono stati valutati gli effetti di queste medicazioni sulle risposte immunitarie e sulla guarigione indipendentemente dall'infezione.
Tutte le medicazioni utilizzate erano disponibili in commercio. Dolding in fibra di gel Kerracel 3M (3M, Knutsford, Regno Unito) è una medicazione in fibra di gel carbossimetilcellulosa (CMC) non antimicrobica che è stata utilizzata come medicazione di controllo in questo studio. Sono state valutate tre medicazioni d'argento CMC antimicrobiche, vale a dire la medicazione Kerracel Ag 3M (3M, Knutsford, Regno Unito), che contiene l'1,7%in peso. Sale d'argento ossigenato (Ag7No11) in ioni argento di valenza più elevati (Ag1+, Ag2+e Ag3+). Durante la decomposizione degli ioni Ag7No11, Ag1+, Ag2+ e Ag3+ sono formati in un rapporto di 1: 2: 4. Aquacel AG Azioni extra contenente l'1,2% di cloruro d'argento (Ag1+) (Condatec, Deeside, Regno Unito) 13 e Aquacel Ag+Squadra extra contenente l'1,2% di cloruro d'argento (AG1+), EDTA e Benzethonium cloruro (Condatec, Deeside, Regno Unito) 14.
I ceppi utilizzati in questo studio erano Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) e Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
I batteri sono stati coltivati durante la notte nel brodo di Muller-Hinton (Oxoid, Altrincham, Regno Unito). La coltura durante la notte è stata quindi diluita 1: 100 nel brodo Mueller-Hinton e 200 µl placcati su sterili membrane Whatman Ciclopore di Whatman (Whatman Plc, Maidstone, Regno Unito) su Mueller-Hinton Agar Prices (Sigma-Aldrich Company Ltd, Kent, Great Britain, Britain, Gran Bretagna ). ) Formazione di biofilm coloniale a 37 ° C per 24 ore. Questi biofilm coloniali sono stati testati per il restringimento logaritmico.
Tagliare la medicazione in pezzi quadrati da 3 cm2 e pre-miscuglio con acqua deionizzata sterile. Posizionare la benda sul biofilm della colonia sulla piastra di agar. Ogni 24 ha di biofilm veniva rimosso e i batteri vitali all'interno del biofilm (CFU/mL) sono stati quantificati mediante diluizione seriale (da 10-1 a 10−7) nel brodo di neutralizzazione ad angolo diurno (Merck-millipore). Dopo 24 ore di incubazione a 37 ° C, sono stati eseguiti conteggi di piastre standard su piastre di agar Mueller-Hinton. Ogni trattamento e punto temporale sono stati eseguiti in triplicato e i conteggi delle piastre sono stati ripetuti per ogni diluizione.
La pelle di pancetta di maiale è ottenuta da grandi maiali bianchi di grandi dimensioni entro 15 minuti dalla macellazione in conformità con gli standard di esportazione dell'Unione europea. La pelle è stata rasata e pulita con salviette di alcol, quindi congelata a -80 ° C per 24 ore per devitalizzare la pelle. Dopo lo scongelamento, 1 cm2 pezzi di pelle sono stati lavati tre volte con PBS, ipoclorito di sodio allo 0,6% e il 70% di etanolo per 20 minuti ogni volta. Prima di rimuovere l'epidermide, rimuovere qualsiasi etanolo rimanente lavando 3 volte in PBS sterile. La pelle è stata coltivata in una piastra da 6 pozzetti con una membrana di nylon a spessore di 0,45 μm (Merck-millipore) in cima e 3 cuscinetti assorbenti (Merck-milipore) contenenti 3 ml di siero bovino fetale (Sigma) integrato con il 10% di dulbecco modificato Aquila. Medio (Medium Eagle modificato di Dulbecco - Aldrich Ltd.).
I biofilm coloniali sono stati coltivati come descritto per gli studi di esposizione al biofilm. Dopo aver coltivato il biofilm sulla membrana per 72 ore, il biofilm è stato applicato sulla superficie della pelle usando un ciclo di inoculazione sterile e la membrana è stata rimossa. Il biofilm è stato quindi incubato sul derma del maiale per altre 24 ore a 37 ° C per consentire al biofilm di maturare e aderire alla pelle del maiale. Dopo che il biofilm era maturato e attaccato, una medicazione da 1,5 cm2, pre-montata con acqua distillata sterile, è stata applicata direttamente sulla superficie della pelle e incubata a 37 ° C per 24 ore. I batteri vitali sono stati visualizzati mediante colorazione applicando uniformemente il reagente di vitalità delle cellule Prestoblue (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, Regno Unito) sulla superficie apicale di ogni espianto e incubandolo per 5 minuti. Utilizzare la fotocamera digitale Leica DFC425 per acquisire immediatamente immagini sul microscopio Leica MZ8. Le aree colorate rosa sono state quantificate utilizzando Image Pro Software versione 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (Mediacy.com)). La microscopia elettronica a scansione è stata eseguita come descritto di seguito.
I batteri coltivati durante la notte sono stati diluiti 1: 100 nel brodo Mueller-Hinton. 200 ml di coltura sono stati aggiunti alla membrana sterile di Whatman Cyclopore da 0,2 μm (Whatman, Maidstone, Regno Unito) e placcata su Mueller-Hinton Agar. Le piastre di biofilm sono state incubate a 37 ° C per 72 ore per consentire la formazione di biofilm matura.
Dopo 3 giorni di maturazione del biofilm, una fasciatura quadrata di 3 cm2 è stata posizionata direttamente sul biofilm e incubata a 37 ° C per 24 ore. Dopo aver rimosso la fasciatura dalla superficie del biofilm, sono stati aggiunti 1 ml di reagente di vitalità delle cellule di Prestoblue (Invitrogen, Waltham, MA) alla superficie di ciascun biofilm per 20 secondi. Le superfici sono state asciugate prima che i cambi di colore fossero registrati utilizzando una fotocamera digitale Nikon D2300 (Nikon UK Ltd., Kingston, Regno Unito).
Prepara le culture durante la notte su Mueller-Hinton Agar, trasferisci le singole colonie a 10 ml di brodo Mueller-Hinton e incubati su uno shaker a 37 ° C (100 giri / min). Dopo l'incubazione notturna, la coltura è stata diluita 1: 100 nel brodo Mueller-Hinton e 300 µl sono stati individuati su una membrana circolare di Whatman CycloPore da 0,2 µm (Whatman International, Maidstone, Regno Unito) su Mueller-Hinton Agar e incubata a 37 ° C entro 72 ore entro 72 ore in 72 ore . . Il biofilm maturo è stato applicato alla ferita come descritto di seguito.
Tutti i lavori con animali sono stati condotti presso l'Università di Manchester con una licenza di progetto approvata dall'Ufficio per il benessere degli animali e la revisione etica (P8721BD27) e in conformità con le linee guida pubblicate dal Ministero degli Interni ai sensi dell'ASPA rivisto del 2012. Tutti gli autori hanno aderito alle linee guida di arrivo. I topi C57BL/6J di otto settimane (Envigo, Oxon, Regno Unito) sono stati usati per tutti gli studi in vivo. I topi sono stati anestetizzati con isoflurano (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, Regno Unito) e le loro superfici dorsali sono state rasate e pulite. A ciascun topo è stata quindi data una ferita escissionale di 2 × 6 mm usando un pugno di biopsia Stiefel (Schuco International, Hertfordshire, Regno Unito). Per le ferite infette dal biofilm, applicare un biofilm coloniale di 72 ore coltivato sulla membrana come descritto sopra allo strato dermico della ferita usando un ciclo di inoculazione sterile immediatamente dopo lesioni e scartare la membrana. Un centimetro quadrato di medicazione è pre-montato con acqua sterile per mantenere un ambiente di ferita umida. Le medicazioni sono state applicate direttamente a ciascuna ferita e coperte con film Tegaderm 3M (3M, Bracknell, Regno Unito) e adesivo liquido Mastisol (Eloquest Healthcare, Ferndale, MI) applicato attorno ai bordi per fornire un'adesione aggiuntiva. La buprenorfina (Animalcare, York, Regno Unito) è stata somministrata ad una concentrazione di 0,1 mg/kg come analgesico. Topi, tre giorni dopo l'infortunio utilizzando il metodo dell'Allegato 1 e rimuovere, dimezzare e conservare l'area della ferita secondo necessità.
La colorazione dell'ematossilina (Thermofisher Scientific) ed eosina (Thermofisher Scientific) è stata eseguita secondo il protocollo del produttore. L'area della ferita e la reepitelializzazione sono state quantificate utilizzando Image Pro Software versione 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
Le sezioni tissutali sono state devastate nello xilene (Thermofisher Scientific, Loughborough, Regno Unito), reidratate con etanolo graduale al 100-50% e brevemente immerse in acqua deionizzata (Thermofisher Scientific). L'immunoistochimica è stata eseguita utilizzando il kit Vectastain Elite ABC PK-6104 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) secondo il protocollo del produttore. Gli anticorpi primari per i neutrofili NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) e macrofagi MS CD107B M3/84 puri (BD Biosciences, Wokingham, Regno Unito) sono stati diluiti 1: 100 in soluzione di blocco e aggiunti alla superficie di taglio, seguita da 2 anticorpi anti-, vettani, vettani Il kit di substrato ABC e Vector Nova Red Perossidasi (HRP) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) e controcolorato con ematossilina. Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio Olympus BX43 e una fotocamera digitale Olympus DP73 (Olympus, Southend-on-Sea, Regno Unito).
I campioni di pelle sono stati fissati in glutaraldeide al 2,5% e formaldeide al 4% in HEPE 0,1 M (pH 7,4) per 24 ore a 4 ° C. I campioni sono stati disidratati usando etanolo graduato ed essiccati in CO2 usando un asciugacapelli critici Quorum K850 (Quorum Technologies Ltd, Loughton, Regno Unito) e sputter rivestiti con lega d'oro-paladium usando un sistema di spruttore Mini Sputterer/Glow Scarico. I campioni sono stati ripresi utilizzando un microscopio elettronico a scansione FEI Quanta 250 (Thermofisher Scientific) per visualizzare il punto centrale della ferita.
Lo ioduro toto-1 (2 μm) è stato applicato sulla superficie della ferita del topo aspirato e incubata per 5 minuti a 37 ° C (Thermofisher Scientific) e trattato con Syto-60 (10 μM) a 37 ° C (Thermofisher Scientific). Le immagini dello stack Z di 15 minuti sono state create utilizzando un Leica TCS SP8.
I dati replicati biologici e tecnici sono stati tabulati e analizzati utilizzando il software GraphPad Prism V9 (GraphPad Software, La Jolla, CA). L'analisi a senso unico della varianza con confronti multipli usando il test post hoc di Dunnett è stata utilizzata per testare le differenze tra ciascun trattamento e la medicazione di controllo non antimicrobica. Un valore P <0,05 è stato considerato significativo.
L'efficacia delle medicazioni fibrose in gel d'argento è stata prima valutata contro le colonie di biofilm di Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa in vitro. Le medicazioni d'argento contengono diverse formule di argento: tradizionali medicazioni argento producono ioni Ag1+; Le medicazioni d'argento, che possono produrre ioni Ag1+ dopo l'aggiunta di EDTA/BC, possono distruggere la matrice di biofilm ed esporre i batteri all'argento sotto l'effetto antibatterico dell'argento. IONS15 e medicazioni contenenti sali di Ag ossigenato che producono ioni Ag1+, Ag2+ e Ag3+. La sua efficacia è stata confrontata con una medicazione di controllo non antimicrobica realizzata con fibre gelificate. I batteri vitali rimanenti all'interno del biofilm sono stati valutati ogni 24 ore per 8 giorni (Figura 1). Il giorno 5, il biofilm è stato reinocolato con 3,85 × 105 secondi. Staphylococcus aureus o 1,22 × 105p. Aeruginosa per valutare il recupero del biofilm. Rispetto alle medicazioni di controllo non antimicrobiche, le medicazioni AG1+ hanno avuto un effetto minimo sulla vitalità batterica nello Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa biofilm per 5 giorni. Al contrario, le medicazioni contenenti i sali di Ag ossigenato e Ag1 + + EDTA/BC erano efficaci nell'uccidere i batteri all'interno del biofilm entro 5 giorni. Dopo ripetuti inoculazioni con batteri planctonici il giorno 5, non è stato osservato alcun ripristino del biofilm (Fig. 1).
Quantificazione di batteri vitali nello Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa biofilm dopo il trattamento con medicazioni d'argento. Le colonie di biofilm di Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa sono state trattate con medicazioni d'argento o medicazioni di controllo non antimicrobiche e il numero di batteri vitali rimanenti è stato determinato ogni 24 ore. Dopo 5 giorni, il biofilm è stato reinocolato con 3,85 × 105 secondi. Staphylococcus aureus o 1,22 × 105p. Le colonie del batterioplancton Pseudomonas aeruginosa si sono formate individualmente per valutare il recupero del biofilm. I grafici mostrano l'errore standard medio +/-.
Per visualizzare l'effetto delle medicazioni d'argento sulla vitalità del biofilm, le medicazioni sono state applicate a biofilm maturi coltivati su pelle suina ex vivo. Dopo 24 ore, la medicazione viene rimossa e il biofilm viene colorato con un colorante reattivo blu, che viene metabolizzato dai batteri viventi a un colore rosa. I biofilm trattati con medicazioni di controllo erano rosa, indicando la presenza di batteri vitali all'interno del biofilm (Figura 2A). Al contrario, il biofilm trattato con la medicazione di Oxysols AG era principalmente blu, indicando che i restanti batteri sulla superficie della pelle del maiale erano batteri non vitali (Figura 2B). La colorazione blu e rosa mista è stata osservata nei biofilm trattati con medicazioni contenenti AG1+, indicando la presenza di batteri vitali e non vitali all'interno del biofilm (Figura 2C), mentre i medicazioni EDTA/BC contenenti Ag1+ erano prevalentemente blu con alcuni punti rosa. indicando le aree non colpite dalla medicazione d'argento (Figura 2D). La quantificazione delle aree attive (rosa) e inattive (blu) ha mostrato che la patch di controllo era attiva del 75% (Figura 2E). Le medicazioni AG1 + + EDTA/BC si sono esibite in modo simile a medicazioni sale Ag ossigenate, con tassi di sopravvivenza rispettivamente del 13% e del 14%. La medicazione AG1+ ha anche ridotto la vitalità batterica del 21%. Questi biofilm sono stati quindi osservati usando la microscopia elettronica a scansione (SEM). Dopo il trattamento con la medicazione di controllo e la medicazione Ag1+, è stato osservato uno strato di pseudomonas aeruginosa che copre la pelle suina (Figura 2F, H), mentre dopo il trattamento con la medicazione Ag1+, sono state trovate poche cellule batteriche e sono state trovate poche cellule batteriche sotto. Le fibre di collagene possono essere considerate come la struttura tissutale della pelle suina (Figura 2G). Dopo il trattamento con medicazione Ag1 + + EDTA/BC, erano visibili placche batteriche e placche di fibra di collagene sottostanti (Figura 2i).
Visualizzazione del biofilm di Pseudomonas aeruginosa dopo il trattamento della medicazione in argento. (A-D) La vitalità batterica nei biofilm di Pseudomonas aeruginosa coltivati su pelle suina è stata visualizzata usando la tintura di vitalità prestablue 24 ore dopo il trattamento con medicazioni d'argento o medicazioni di controllo non antimicrobiche. I batteri vivi sono rosa, i batteri non vitali e la pelle di maiale sono blu. (E) Quantificazione dei biofilm di Pseudomonas aeruginosa coltivati su pelle suina (punto rosa) usando la microscopia elettronica a scansione Image Pro versione 10 (FI) e trattati con una medicazione in argento o una medicazione non antimicrobica per 24 ore. Barra di scala SEM = 5 µm. (J - M) i biofilm coloniali sono cresciuti su filtri e sono stati colorati con colorante reattivo di Prestoblue dopo 24 ore di incubazione con medicazioni d'argento.
Per determinare se lo stretto contatto tra le medicazioni e i biofilm ha influenzato l'efficacia delle medicazioni, i biofilm coloniali posizionati su una superficie piana sono stati trattati con le medicazioni per 24 ore e quindi colorati con coloranti reattivi. Il biofilm non trattato era di colore rosa scuro (Figura 2J). Contrariamente ai biofilm trattati con medicazioni contenenti sali di Ag ossigenato (Figura 2K), i biofilm trattati con medicazioni contenenti Ag1+ o Ag1++ EDTA/BC hanno mostrato bande di colorazione rosa (Figura 2L, M). Questa colorazione rosa indica la presenza di batteri vitali ed è associata all'area della sutura all'interno della medicazione. Queste aree cucite nelle aree creano spazi morti che consentono ai batteri all'interno del biofilm di sopravvivere.
Per valutare l'efficacia delle medicazioni d'argento in vivo, le ferite asportate a tutto spessore di topi infettati con biofilm maturi di S. aureus e P. aeruginosa sono stati trattati con medicazioni di controllo non antimicrobiche o medicazioni d'argento. Dopo 3 giorni di trattamento, l'analisi macroscopica dell'immagine ha mostrato dimensioni di ferite più piccole se trattate con medicazioni a sale ossigenato rispetto ai medicazioni di controllo non antimicrobiche e ad altri medicazioni argento (Figura 3A-H). Per confermare queste osservazioni, le ferite sono state raccolte e l'area della ferita e la reepitelializzazione sono state quantificate su sezioni di tessuto con ematossilina ed eosina utilizzando Image Pro Software versione 10 (Figura 3i-L).
L'effetto delle medicazioni d'argento sulla superficie della ferita e la riepitelializzazione delle ferite infettate da biofilm. (A - H) Piccole cellule infettate da biofilm di Pseudomonas aeruginosa (A - D) e Staphylococcus aureus (E - H) dopo tre giorni di trattamento con una medicazione non antimicrobica, una medicazione a sale Ag ossigenata, una medicazione Ag1+ e una Ag1+ vestirsi. Immagini macroscopiche rappresentative. Ferite di topi con condimento Ag1 + + EDTA/BC. (IL) Infezione rappresentativa di Pseudomonas aeruginosa, sezioni istologiche colorate con ematossilina ed eosina, utilizzate per quantificare l'area della ferita e la rigenerazione epiteliale. Quantificazione dell'area della ferita (M, O) e di reepitelializzazione percentuale (N, P) delle ferite infette da Pseudomonas aeruginosa (M, N) e Staphylococcus aureus (O, P) biofilm (per gruppo di trattamento N = 12). I grafici mostrano l'errore standard medio +/-. * significa p = <0,05 ** significa p = <0,01; Scala macroscopica = 2,5 mm, scala istologica = 500 µm.
La quantificazione dell'area della ferita nelle ferite infettate da pseudomonas aeruginosa biofilm (Figura 3M) ha mostrato che le ferite trattate con ossisalt Ag avevano una dimensione media della ferita di 2,5 mm2, mentre la medicazione non antimicrobica aveva una dimensione media della ferita di 3,1 mm2, che non è VERO. ha raggiunto un significato statistico (Figura 3M). p = 0,423). Le ferite trattate con Ag1+ o Ag1++ EDTA/BC non hanno mostrato una riduzione nell'area della ferita (rispettivamente 3,1 mm2 e 3,6 mm2). Il trattamento con medicazione di sale Ag ossigenato ha promosso la riepitelializzazione in misura maggiore rispetto alla medicazione di controllo non antimicrobica (rispettivamente 34% e 15%; P = 0,029) e Ag1+ o Ag1++ EDTA/BC (10% e 11%) (11%) (11%) (11%) (11%) (11%) Figura 3n). . , rispettivamente).
Tendenze simili nell'area della ferita e rigenerazione epiteliale sono state osservate in ferite infettate da biofilm di S. aureus (Figura 3O). Le medicazioni contenenti sali d'argento ossigenato hanno ridotto l'area della ferita (2,0 mm2) del 23% rispetto alla medicazione non antimicrobica di controllo (2,6 mm2), sebbene questa riduzione non fosse significativa (p = 0,304) (Fig. 3O). Inoltre, l'area della ferita nel gruppo di trattamento AG1+ è stata leggermente ridotta (2,4 mm2), mentre la ferita trattata con la medicazione Ag1++ EDTA/BC non ha ridotto l'area della ferita (2,9 mm2). I sali di ossigeno di AG hanno anche promosso la riepitelializzazione delle ferite infettate con biofilm di S. aureus (31%) in misura maggiore rispetto a quelle trattate con medicazioni di controllo non antimicrobiche (12%, p = 0,003) (Figura 3P). La medicazione Ag1+ (16%, P = 0,903) e Ag+ 1+ EDTA/BC (14%, P = 0,965) hanno mostrato livelli di rigenerazione epiteliale in modo simile al controllo.
Per visualizzare l'effetto delle medicazioni d'argento sulla matrice biofilm, sono state eseguite la colorazione di ioduro Toto 1 e Syto 60 (Fig. 4). Toto 1 ioduro è un colorante impermeabile per cellule che può essere utilizzato per visualizzare accuratamente gli acidi nucleici extracellulari, che sono abbondanti nell'EPS dei biofilm. Syto 60 è un colorante permeabile alle celle usato come controcolora16. Le osservazioni di Toto 1 e Syto 60 ioduro in ferite inoculate con biofilm di Pseudomonas aeruginosa (Figura 4A-D) e Staphylococcus aureus (Figura 4i-L) hanno mostrato che dopo 3 giorni di trattamento, EPS nel biofilm è stato significativamente ridotto. contenenti sali ossigenati AG e Ag1 + + EDTA/BC. Le medicazioni Ag1+ senza ulteriori componenti anti-antibiofilm hanno ridotto significativamente il DNA privo di cellule nelle ferite inoculate con Pseudomonas aeruginosa ma erano meno efficaci nelle ferite inoculate con Staphylococcus aureus.
Imaging in vivo del biofilm della ferita dopo 3 giorni di trattamento con controllo o medicazioni d'argento. Immagini confocali di Pseudomonas aeruginosa (A - D) e Staphylococcus aureus (I - L) colorate con toto 1 (verde) per visualizzare acidi nucleici extracellulari, un componente di polimeri di biofilm extracellulare. Per colorare gli acidi nucleici intracellulari, utilizzare Syto 60 (rosso). acidi. P. Microscopia elettronica a scansione di ferite infettate da pseudomonas aeruginosa (E - H) e Staphylococcus aureus (M - P) biofilm dopo 3 giorni di trattamento con controllo e medicazioni d'argento. Barra di scala SEM = 5 µm. Barra della scala di imaging confocale = 50 µm.
La microscopia elettronica a scansione ha mostrato che i topi inoculati con colonie di biofilm di Pseudomonas aeruginosa (Figura 4E-H) e Staphylococcus aureus (Figura 4M-P) avevano significativamente meno batteri nelle loro ferite dopo 3 giorni di trattamento con tutti i condimenti in argento.
Per valutare l'effetto delle medicazioni d'argento sull'infiammazione della ferita nei topi infetti dal biofilm, le sezioni di ferite infette dal biofilm trattate con controllo o medicazioni d'argento per 3 giorni sono state macchiate immunoistochimicamente utilizzate con anticorpi specifici per neutrofili e macrofagi. Determinazione quantitativa di neutrofili e macrofagi internamente. tessuto di granulazione. Figura 5). Tutte le medicazioni d'argento hanno ridotto il numero di neutrofili e macrofagi nelle ferite infettate da Pseudomonas aeruginosa rispetto ai medicazioni di controllo non antimicrobiche dopo tre giorni di trattamento. Tuttavia, il trattamento con la medicazione argentata ossigenata ha comportato una maggiore riduzione dei neutrofili (p = <0,0001) e dei macrofagi (p = <0,0001) rispetto ad altre medicazioni argento testate (Figura 5i, J). Sebbene Ag1++ EDTA/BC abbia avuto un effetto maggiore sul biofilm della ferita, ha ridotto i livelli di neutrofili e macrofagi in misura minori rispetto alla medicazione Ag1+. Ferite moderate infettate con biofilm di S. aureus sono state osservate anche dopo la medicazione con Oxisols Ag (P = <0,0001), Ag1+ (P = 0,0008) e Ag1 ++ EDTA/BC (P = 0,0043) rispetto al controllo. Tendenze simili sono osservate per la neutropenia. Bandage (Fig. 5K). Tuttavia, solo la medicazione di sale Ag ossigenata ha mostrato una riduzione significativa del numero di macrofagi nel tessuto di granulazione rispetto al controllo nelle ferite infettate da biofilm di S. aureus (P = 0,0339) (Figura 5L).
I neutrofili e i macrofagi sono stati quantificati in ferite infettate da pseudomonas aeruginosa e biofilm di Staphylococcus aureus dopo 3 giorni di trattamento con controllo non antimicrobico o medicazioni d'argento. I neutrofili (AD) e i macrofagi (EH) sono stati quantificati in sezioni di tessuto colorate con anticorpi specifici per neutrofili o macrofagi. Quantificazione di neutrofili (I e K) e macrofagi (J e L) in ferite infettate da Pseudomonas aeruginosa (I e J) e Staphylococcus aureus (K&L) biofilm. N = 12 per gruppo. I grafici mostrano l'errore standard medio +/-, i valori di significatività rispetto alla medicazione non antibatterica, * significa p = <0,05, ** significa p = <0,01; *** significa p = <0,001; indica p = <0,0001).
Abbiamo quindi valutato l'effetto delle medicazioni d'argento sulla guarigione indipendente dall'infezione. Le ferite escissionali non infette sono state trattate con una medicazione non antimicrobica o una medicazione in argento per 3 giorni (Figura 6). Tra le medicazioni d'argento testate, solo le ferite trattate con la medicazione a sale ossigenato apparivano più piccole su immagini macroscopiche rispetto alle ferite trattate con il controllo (Figura 6A-D). La quantificazione dell'area della ferita mediante analisi istologica ha mostrato che l'area media della ferita dopo il trattamento con la medicazione Ag Oxysols era di 2,35 mm2 rispetto a 2,96 mm2 per le ferite trattate con il gruppo di controllo, ma questa differenza non ha raggiunto un significato statistico (P = 0,488) (Fig) . 6i). Al contrario, non è stata osservata alcuna riduzione nell'area della ferita dopo il trattamento con medicazioni Ag1+ (3,38 mm2, p = 0,757) o Ag1++ EDTA/BC (4,18 mm2, p = 0,054) rispetto al gruppo di controllo. È stato osservato un aumento della rigenerazione epiteliale con la medicazione Oxysol AG rispetto al gruppo di controllo (rispettivamente 30% contro 22%), sebbene ciò non abbia raggiunto significato (p = 0,067), questo è abbastanza significativo e conferma i risultati precedenti. Una medicazione con Oxysols promuove la riepitelializzazione. -Epitelizzazione di ferite non infette17. Al contrario, il trattamento con le medicazioni Ag1+ o Ag1++ EDTA/BC non ha avuto alcun effetto o ha mostrato una ridotta riepitelializzazione rispetto al controllo.
Effetto della medicazione della ferita d'argento sulla guarigione della ferita in topi non infetti con resezione completa. (AD) Immagini macroscopiche rappresentative di ferite dopo tre giorni di trattamento con una medicazione non antimicrobica e una medicazione d'argento. (EH) sezioni di ferita rappresentativa colorate con ematossilina ed eosina. La quantificazione dell'area della ferita (I) e la percentuale di reepitelializzazione (J) sono state calcolate da sezioni istologiche nel punto medio della ferita usando il software di analisi delle immagini (n = 11–12 per gruppo di trattamento). I grafici mostrano l'errore standard medio +/-. * significa p = <0,05.
L'argento ha una lunga storia di utilizzo come terapia antimicrobica nella guarigione delle ferite, ma le diverse formulazioni e metodi di consegna possono causare differenze nell'efficacia antimicrobica 18. Inoltre, le proprietà antibiofilm di specifici sistemi di consegna d'argento non sono completamente comprese. Sebbene la risposta immunitaria dell'ospite sia relativamente efficace contro i batteri planctonici, è generalmente meno efficace contro i biofilms19. I batteri planctonici sono prontamente fagocitati dai macrofagi, ma all'interno di biofilm, le cellule aggregate pongono ulteriori problemi limitando la risposta dell'ospite nella misura in cui le cellule immunitarie possono sottoporsi all'apoptosi e rilasciare fattori proinfiammatori per migliorare la risposta immunitaria20. È stato osservato che alcuni leucociti possono penetrare nel biofilms21 ma non sono in grado di fagocitosio una volta che questa difesa è compromessa22. Un approccio olistico dovrebbe essere utilizzato per supportare la risposta immunitaria dell'ospite contro l'infezione da biofilm della ferita. Il debridement delle ferite può interrompere fisicamente il biofilm e rimuovere la maggior parte del bioburdo, ma la risposta immunitaria dell'ospite può essere inefficace contro il restante biofilm, specialmente se la risposta immunitaria dell'ospite è compromessa. Pertanto, le terapie antimicrobiche come le medicazioni d'argento possono supportare la risposta immunitaria dell'ospite ed eliminare le infezioni da biofilm. La composizione, la concentrazione, la solubilità e il substrato di consegna possono influenzare l'efficacia antimicrobica dell'argento. Negli ultimi anni, i progressi nella tecnologia di elaborazione dell'argento hanno reso queste medicazioni più efficaci 9,23. Con l'avanzare della tecnologia Silver Dressing, è importante comprendere l'efficacia di queste medicazioni nel controllo delle infezioni della ferita e, soprattutto, l'impatto di queste potenti forme di argento sull'ambiente della ferita e sulla guarigione.
In questo studio, abbiamo confrontato l'efficacia di due medicazioni d'argento avanzate con medicazioni d'argento convenzionali che producono ioni Ag1+ contro biofilm usando diversi modelli in vitro e in vivo. Abbiamo anche valutato l'effetto di queste medicazioni sull'ambiente della ferita e sulla guarigione indipendente dalle infezioni. Per ridurre al minimo l'influenza della matrice di consegna, tutte le medicazioni d'argento testate sono state composte da carbossimetilcellulosa.
La nostra valutazione preliminare di queste medicazioni d'argento contro i biofilmi coloniali di Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus mostra che, a differenza dei tradizionali medicazioni Ag1+, due medicazioni d'argento avanzate, Ag1++ EDTA/BC e Salti Ag Oxygenate qualche giorno. Inoltre, questi condimenti impediscono la ri-formazione del biofilm dopo un'esposizione ripetuta ai batteri planctonici. La medicazione Ag1+ conteneva cloruro d'argento, lo stesso composto d'argento e la matrice di base di Ag1++ EDTA/BC, e aveva un effetto limitato sulla vitalità batterica all'interno del biofilm nello stesso periodo. L'osservazione che una medicazione Ag1++ EDTA/BC era più efficace contro il biofilm di una medicazione Ag1+ costituita dalla stessa matrice e che un composto d'argento supporta l'idea che sono necessari ulteriori ingredienti per aumentare l'efficacia del cloruro d'argento contro il biofilm, come è stato riportato altrove15. Questi risultati supportano l'idea che BC ed EDTA svolgano un ruolo aggiuntivo che contribuisce all'efficacia generale della medicazione e che l'assenza di questo componente nelle medicazioni AG1+ possa aver contribuito alla mancata dimostrazione dell'efficacia in vitro. Abbiamo scoperto che le medicazioni saline di Ag ossigenate che producono ioni Ag2+ e Ag3+ presentavano un'efficacia antibatterica più forte di Ag1+ e a livelli simili a Ag1++ EDTA/BC. Tuttavia, a causa dell'elevato potenziale redox, non è chiaro per quanto tempo gli ioni Ag3+ rimangono attivi ed efficaci contro i biofilm della ferita e quindi meritano ulteriori studi. Inoltre, ci sono molte medicazioni diverse che generano ioni Ag1+ che non sono stati testati in questo studio. Queste medicazioni sono composte da diversi composti d'argento, concentrazioni e matrici di base, che possono influenzare la consegna di ioni Ag1+ e la loro efficacia contro i biofilm. Vale anche la pena notare che ci sono molti modelli diversi in vitro e in vivo utilizzati per valutare l'efficacia delle medicazioni delle ferite contro i biofilm. Il tipo di modello utilizzato, nonché il contenuto di sale e proteina dei media utilizzati in questi modelli, influenzerà l'efficacia della medicazione. Nel nostro modello in vivo, abbiamo permesso al biofilm di maturare in vitro e quindi trasferirlo sulla superficie cutanea della ferita. La risposta immunitaria del topo ospite è relativamente efficace contro i batteri planctonici applicati alla ferita, formando così un biofilm mentre la ferita guarisce. L'aggiunta di biofilm maturo a una ferita limita l'efficacia della risposta immunitaria dell'ospite alla formazione di biofilm consentendo al biofilm maturo di affermarsi all'interno della ferita prima che possa iniziare la guarigione. Pertanto, il nostro modello ci consente di valutare l'efficacia delle medicazioni antimicrobiche su biofilm maturi prima che le ferite inizino a guarire.
Abbiamo anche scoperto che la vestibilità ha influenzato l'efficacia delle medicazioni d'argento sui biofilm in vitro e la pelle suina. Lo stretto contatto con la ferita è considerato fondamentale per l'efficacia antimicrobica della medicazione24,25. Le medicazioni contenenti sali di Ag ossigenato erano in stretto contatto con biofilm maturi, con conseguente riduzione significativa del numero di batteri vitali all'interno del biofilm dopo 24 ore. Al contrario, quando trattati con medicazioni Ag1+ e Ag1++ EDTA/BC, sono rimasti un numero significativo di batteri vitali. Questi condimenti contengono suture lungo l'intera lunghezza della medicazione, che crea spazi morti che impediscono un stretto contatto con il biofilm. Nei nostri studi in vitro, queste aree senza contatto hanno impedito l'uccisione di batteri vitali all'interno del biofilm. Abbiamo valutato la vitalità batterica solo dopo 24 ore di trattamento; Nel tempo, man mano che la medicazione diventa più satura, potrebbe esserci meno spazio morto, riducendo l'area per questi batteri vitali. Tuttavia, ciò evidenzia l'importanza della composizione della medicazione, non solo il tipo di argento nella medicazione.
Mentre gli studi in vitro sono utili per confrontare l'efficacia di diverse tecnologie d'argento, è anche importante comprendere gli effetti di queste medicazioni sui biofilm in vivo, dove i tessuti ospiti e le risposte immunitarie contribuiscono all'efficacia delle medicazioni contro i biofilm. L'effetto di queste medicazioni sui biofilm della ferita è stato osservato usando la microscopia elettronica a scansione e la colorazione EPS del biofilm usando coloranti di DNA intracellulari ed extracellulari. Abbiamo scoperto che dopo 3 giorni di trattamento, tutte le medicazioni erano efficaci nel ridurre il DNA privo di cellule nelle ferite infette dal biofilm, ma la medicazione Ag1+ era meno efficace nelle ferite infette da Staphylococcus aureus. La microscopia elettronica a scansione ha anche mostrato che erano presenti batteri significativamente meno nelle ferite trattate con i medicazioni d'argento, sebbene ciò fosse più pronunciato con la medicazione di sale Ag ossigenato e la medicazione AG1++ EDTA/BC rispetto alla medicazione AG1+. Questi dati mostrano che le medicazioni argentate testate avevano vari gradi di impatto sulla struttura del biofilm, ma nessuna delle medicazioni d'argento era in grado di sradicare il biofilm, a sostegno della necessità di un approccio olistico al trattamento delle infezioni del biofilm della ferita; Uso di bracciali d'argento. Il trattamento è preceduto dallo sbrigliamento fisico per rimuovere la maggior parte del biofilm.
Le ferite croniche sono spesso in uno stato di grave infiammazione, con cellule infiammatorie in eccesso che rimangono nel tessuto della ferita per un lungo periodo di tempo, causando danni ai tessuti e esaurimento dell'ossigeno necessario per efficiente metabolismo cellulare e funzione nella ferita26. I biofilm esacerbano questo ambiente ostile della ferita influenzando negativamente la guarigione in vari modi, tra cui l'inibizione della proliferazione cellulare e della migrazione e l'attivazione delle citochine proinfiammatorie27. Man mano che le medicazioni d'argento diventano più efficaci, è importante comprendere l'impatto che hanno sull'ambiente della ferita e sulla guarigione.
È interessante notare che, sebbene tutte le medicazioni d'argento influenzino la composizione del biofilm, solo le medicazioni di sale argento ossigenato hanno aumentato la riepitelializzazione di queste ferite infette. Questi dati supportano i nostri risultati precedenti17 e quelli di Kalan et al. (2017) 28, che hanno dimostrato una buona sicurezza e profili di tossicità dei sali d'argento ossigenato, poiché concentrazioni più basse di argento erano efficaci contro i biofilm.
Il nostro studio attuale evidenzia le differenze nella tecnologia d'argento tra medicazioni d'argento antimicrobiche e l'impatto di questa tecnologia sull'ambiente della ferita e sulla guarigione indipendente dalle infezioni. Tuttavia, questi risultati differiscono da studi precedenti che dimostrano che la medicazione Ag1 + + EDTA/BC ha migliorato i parametri di guarigione delle orecchie di coniglio ferite in vivo. Tuttavia, ciò può essere dovuto alle differenze nei modelli animali, nei tempi di misurazione e nei metodi di applicazione batterica29. In questo caso, sono state prese misurazioni della ferita 12 giorni dopo lesioni per consentire agli ingredienti attivi della medicazione di agire sul biofilm per un periodo di tempo più lungo. Ciò è supportato da uno studio che ha dimostrato che le ulcere delle gambe clinicamente infette trattate con Ag1 + + EDTA/BC inizialmente sono aumentate di dimensioni dopo una settimana di trattamento, e quindi nelle prossime 3 settimane di trattamento con Ag1 + + EDTA/BC e entro 4 settimane da Uso di non antimicrobici. droghe. Discussioni CMC per ridurre le dimensioni di Ulcers30.
Alcune forme e concentrazioni di argento hanno precedentemente dimostrato di essere citotossiche in vitro 11, ma questi risultati in vitro non si traducono sempre in effetti avversi in vivo. Inoltre, i progressi della tecnologia d'argento e una migliore comprensione dei composti d'argento e delle concentrazioni nelle medicazioni hanno portato allo sviluppo di molte medicazioni d'argento sicure ed efficaci. Tuttavia, con l'avanzare della tecnologia Silver Dressing, è importante comprendere l'impatto di queste medicazioni sull'ambiente della ferita 31,32,33. In precedenza è stato riferito che l'aumento del tasso di riepitelializzazione corrisponde ad una percentuale aumentata di macrofagi M2 antinfiammatori rispetto al fenotipo M1 pro-infiammatorio. Ciò è stato notato in un precedente modello di topo in cui le medicazioni per ferite di idrogel d'argento sono state confrontate con la sulfadiazina d'argento e gli idrogels non antimicrobici34.
Le ferite croniche possono esibire un'infiammazione eccessiva ed è stato osservato che la presenza di neutrofili in eccesso può essere dannosa per la guarigione delle ferite35. In uno studio su topi impoveriti di neutrofili, la presenza di neutrofili ha ritardato la reepitelializzazione. La presenza di neutrofili in eccesso porta ad alti livelli di proteasi e specie reattive di ossigeno, come il superossido e il perossido di idrogeno, che sono associati a ferite croniche e lenti37,38. Allo stesso modo, un aumento dei numeri di macrofagi, se non controllato, può portare a una guarigione ritardata della ferita39. Questo aumento è particolarmente importante se i macrofagi non sono in grado di passare da un fenotipo pro-infiammatorio a un fenotipo a favore della guarigione, con conseguenti ferite che non riescono a uscire dalla fase infiammatoria della guarigione40. Abbiamo osservato una diminuzione dei neutrofili e dei macrofagi nelle ferite infette dal biofilm dopo 3 giorni di trattamento con tutte le medicazioni d'argento, ma la riduzione è stata più pronunciata con medicazioni sale ossigenate. Questa diminuzione può essere un risultato diretto della risposta immunitaria all'argento, una risposta alla riduzione del bioburdio o della ferita in una fase successiva di guarigione e quindi le cellule immunitarie nella ferita sono ridotte. Ridurre il numero di cellule infiammatorie nella ferita può mantenere un ambiente favorevole alla guarigione delle ferite. Il meccanismo d'azione di come gli ossisalt di Ag promuovono la guarigione indipendente dall'infezione non è chiaro, ma la capacità degli ossisalti di Ag di produrre ossigeno e distruggere i livelli dannosi di perossido di idrogeno, un mediatore dell'infiammazione, può spiegarlo e richiede ulteriori studi17.
Le ferite infette non guarnite croniche rappresentano un problema sia per i medici che per i pazienti. Sebbene molti medicazioni sostengano l'efficacia antimicrobica, la ricerca raramente si concentra su altri fattori chiave che influenzano il microambiente della ferita. Questo studio mostra che diverse tecnologie d'argento hanno un'efficacia antimicrobica diversa e, soprattutto, diversi effetti sull'ambiente e sulla guarigione della ferita, indipendentemente dalle infezioni. Sebbene questi studi in vitro e in vivo mostrino l'efficacia di queste medicazioni nel trattamento delle infezioni della ferita e nella promozione della guarigione, sono necessari studi randomizzati controllati per valutare l'efficacia di queste medicazioni in clinica.
I set di dati utilizzati e/o analizzati durante lo studio attuale sono disponibili dall'autore corrispondente su ragionevole richiesta.
Tempo post: lug-15-2024