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La crescita microbica nelle ferite si manifesta spesso sotto forma di biofilm, che interferiscono con la guarigione e sono difficili da eradicare. Nuove medicazioni a base di argento affermano di combattere le infezioni delle ferite, ma la loro efficacia antibiofilm e gli effetti sulla guarigione indipendenti dall'infezione sono generalmente sconosciuti. Utilizzando modelli di biofilm in vitro e in vivo di Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, riportiamo l'efficacia di medicazioni generatrici di ioni Ag1+: medicazioni Ag1+ contenenti acido etilendiamminotetraacetico e cloruro di benzetonio (Ag1+/EDTA/BC) e medicazioni contenenti nitrato d'argento (ossisali di Ag), che producono ioni Ag1+, Ag2+ e Ag3+ per combattere il biofilm della ferita e il suo effetto sulla guarigione. Le medicazioni Ag1+ hanno avuto effetti minimi sul biofilm della ferita in vitro e nei topi (C57BL/6j). Al contrario, i sali d'argento ossigenati e le medicazioni Ag1+/EDTA/BC hanno ridotto significativamente il numero di batteri vitali nei biofilm in vitro e hanno dimostrato una significativa riduzione dei componenti batterici ed EPS nei biofilm delle ferite nei topi. Queste medicazioni hanno avuto effetti diversi sulla guarigione delle ferite infette da biofilm e di quelle non infette da biofilm, con le medicazioni a base di sali ossigenati che hanno avuto effetti più benefici sulla riepitelizzazione, sulle dimensioni della ferita e sull'infiammazione rispetto ai trattamenti di controllo e alle altre medicazioni a base di argento. Le diverse proprietà fisico-chimiche delle medicazioni a base di argento possono avere effetti diversi sul biofilm della ferita e sulla guarigione, e questo dovrebbe essere considerato nella scelta di una medicazione per il trattamento delle ferite infette da biofilm.
Le ferite croniche sono definite come “ferite che non riescono a progredire attraverso le normali fasi di guarigione in modo ordinato e tempestivo” 1. Le ferite croniche rappresentano un onere psicologico, sociale ed economico per i pazienti e per il sistema sanitario. La spesa annuale del Servizio Sanitario Nazionale (NHS) per il trattamento delle ferite e delle comorbilità associate è stimata in 8,3 miliardi di sterline nel 2017-182. Le ferite croniche rappresentano attualmente un problema urgente anche negli Stati Uniti, dove Medicare stima un costo annuale per il trattamento dei pazienti affetti da ferite compreso tra 28,1 e 96,8 miliardi di dollari3.
L'infezione è un fattore importante che impedisce la guarigione delle ferite. Le infezioni si manifestano spesso sotto forma di biofilm, presenti nel 78% delle ferite croniche che non guariscono. I biofilm si formano quando i microrganismi si attaccano irreversibilmente alle superfici, come quelle delle ferite, e possono aggregarsi formando comunità produttrici di polimero extracellulare (EPS). Il biofilm della ferita è associato a una maggiore risposta infiammatoria che porta a danni tissutali, i quali possono ritardare o impedire la guarigione4. L'aumento del danno tissutale può essere dovuto in parte all'aumentata attività delle metalloproteinasi della matrice, della collagenasi, dell'elastasi e delle specie reattive dell'ossigeno5. Inoltre, le cellule infiammatorie e i biofilm stessi sono grandi consumatori di ossigeno e possono quindi causare ipossia tissutale locale, privando le cellule dell'ossigeno vitale necessario per un'efficace riparazione dei tessuti6.
I biofilm maturi sono altamente resistenti agli agenti antimicrobici, il che richiede strategie aggressive per controllare le infezioni da biofilm, come il trattamento meccanico seguito da un efficace trattamento antimicrobico. Poiché i biofilm possono rigenerarsi rapidamente, gli antimicrobici efficaci possono ridurre il rischio di riformazione dopo il debridement chirurgico7.
L'argento è sempre più utilizzato nelle medicazioni antimicrobiche e viene spesso impiegato come trattamento di prima linea per le ferite croniche infette. Sono disponibili in commercio numerose medicazioni a base di argento, ognuna con una diversa composizione, concentrazione e matrice di base. I progressi nel campo delle fascette in argento hanno portato allo sviluppo di nuove tipologie di fascette. L'argento metallico (Ag0) è inerte; per ottenere un'efficacia antimicrobica, deve perdere un elettrone per formare l'argento ionico (Ag1+). Le medicazioni tradizionali a base di argento contengono composti d'argento o argento metallico che, a contatto con i liquidi, si decompongono formando ioni Ag1+. Questi ioni Ag1+ reagiscono con la cellula batterica, sottraendo elettroni ai componenti strutturali o ai processi vitali necessari alla sopravvivenza. Una tecnologia brevettata ha portato allo sviluppo di un nuovo composto d'argento, gli ossisali d'argento (nitrato d'argento, Ag7NO11), che viene utilizzato nelle medicazioni per ferite. A differenza dell'argento tradizionale, la decomposizione dei sali contenenti ossigeno produce stati di valenza dell'argento più elevati (Ag1+, Ag2+ e Ag3+). Studi in vitro hanno dimostrato che basse concentrazioni di sali d'argento ossigenati sono più efficaci dell'argento a ioni singoli (Ag1+) contro batteri patogeni come Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus ed Escherichia coli8,9. Un altro nuovo tipo di medicazione a base di argento include ingredienti aggiuntivi, ovvero acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e cloruro di benzetonio (BC), che, secondo quanto riportato, agiscono sul biofilm EPS e aumentano quindi la penetrazione dell'argento nel biofilm. Queste nuove tecnologie a base di argento offrono nuove modalità per colpire i biofilm delle ferite. Tuttavia, è importante valutare l'impatto di questi antimicrobici sull'ambiente della ferita e sulla guarigione indipendente dall'infezione, al fine di garantire che non creino un ambiente sfavorevole o ritardino la guarigione. Sono state segnalate preoccupazioni circa la citotossicità in vitro dell'argento con diverse medicazioni a base di argento10,11. Tuttavia, la citotossicità in vitro non si è ancora tradotta in tossicità in vivo e diverse medicazioni Ag1+ hanno dimostrato un buon profilo di sicurezza12.
In questo studio, abbiamo analizzato l'efficacia di medicazioni a base di carbossimetilcellulosa contenenti nuove formulazioni a base di argento contro il biofilm delle ferite, sia in vitro che in vivo. Inoltre, sono stati valutati gli effetti di queste medicazioni sulle risposte immunitarie e sulla guarigione, indipendentemente dalla presenza di infezione.
Tutte le medicazioni utilizzate erano disponibili in commercio. La medicazione in gel di fibre 3M Kerracel (3M, Knutsford, Regno Unito) è una medicazione in gel di fibre di carbossimetilcellulosa (CMC) al 100% non antimicrobica, utilizzata come medicazione di controllo in questo studio. Sono state valutate tre medicazioni antimicrobiche a base di argento e CMC, ovvero la medicazione 3M Kerracel Ag (3M, Knutsford, Regno Unito), che contiene l'1,7% in peso di sale d'argento ossigenato (Ag7NO11) in ioni d'argento a valenza superiore (Ag1+, Ag2+ e Ag3+). Durante la decomposizione di Ag7NO11, si formano ioni Ag1+, Ag2+ e Ag3+ in un rapporto di 1:2:4. Medicazione Aquacel Ag Extra contenente cloruro d'argento all'1,2% (Ag1+) (ConvaTec, Deeside, Regno Unito) 13 e medicazione Aquacel Ag + Extra contenente cloruro d'argento all'1,2% (Ag1+), EDTA e cloruro di benzetonio (ConvaTec, Deeside, Regno Unito) 14.
I ceppi utilizzati in questo studio erano Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) e Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
I batteri sono stati coltivati per una notte in brodo Mueller-Hinton (Oxoid, Altrincham, Regno Unito). La coltura notturna è stata quindi diluita 1:100 in brodo Mueller-Hinton e 200 µl sono stati piastrati su membrane Whatman Cyclopore sterili da 0,2 µm (Whatman plc, Maidstone, Regno Unito) su piastre di agar Mueller-Hinton (Sigma-Aldrich Company Ltd, Kent, Gran Bretagna). Formazione di biofilm coloniali a 37 °C per 24 ore. Questi biofilm coloniali sono stati testati per la contrazione logaritmica.
Tagliare la medicazione in pezzi quadrati di 3 cm² e pre-inumidirli con acqua deionizzata sterile. Posizionare la medicazione sopra il biofilm della colonia sulla piastra di agar. Ogni 24 ettari di biofilm sono stati rimossi e i batteri vitali presenti nel biofilm (UFC/ml) sono stati quantificati mediante diluizione seriale (da 10⁻¹ a 10⁻⁷) in brodo di neutralizzazione Day-Angle (Merck-Millipore). Dopo 24 ore di incubazione a 37°C, sono state eseguite le conte standard su piastre di agar Mueller-Hinton. Ogni trattamento e punto temporale è stato eseguito in triplicato e le conte sono state ripetute per ogni diluizione.
La pelle di pancetta di maiale è stata ottenuta da scrofe di razza Large White entro 15 minuti dalla macellazione, in conformità con gli standard di esportazione dell'Unione Europea. La pelle è stata rasata e pulita con salviette imbevute di alcol, quindi congelata a -80 °C per 24 ore per devitalizzarla. Dopo lo scongelamento, pezzi di pelle di 1 cm² sono stati lavati tre volte con PBS, ipoclorito di sodio allo 0,6% ed etanolo al 70% per 20 minuti ogni volta. Prima di rimuovere l'epidermide, l'etanolo residuo è stato eliminato lavando tre volte con PBS sterile. La pelle è stata coltivata in una piastra a 6 pozzetti con una membrana di nylon di 0,45 μm di spessore (Merck-Millipore) sulla parte superiore e 3 tamponi assorbenti (Merck-Millipore) contenenti 3 ml di siero fetale bovino (Sigma) integrato con il 10% di terreno di coltura Dulbecco's Modified Eagle Medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium – Aldrich Ltd.).
I biofilm coloniali sono stati coltivati come descritto per gli studi di esposizione al biofilm. Dopo aver coltivato il biofilm sulla membrana per 72 ore, il biofilm è stato applicato sulla superficie cutanea utilizzando un'ansa di inoculazione sterile e la membrana è stata rimossa. Il biofilm è stato quindi incubato sul derma del suino per ulteriori 24 ore a 37 °C per consentirne la maturazione e l'adesione alla pelle del suino. Dopo la maturazione e l'adesione del biofilm, una medicazione di 1,5 cm², pre-inumidita con acqua distillata sterile, è stata applicata direttamente sulla superficie cutanea e incubata a 37 °C per 24 ore. I batteri vitali sono stati visualizzati mediante colorazione applicando uniformemente il reagente di vitalità cellulare PrestoBlue (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, Regno Unito) sulla superficie apicale di ciascun espianto e incubandolo per 5 minuti. Utilizzare la fotocamera digitale Leica DFC425 per acquisire istantaneamente le immagini sul microscopio Leica MZ8. Le aree colorate di rosa sono state quantificate utilizzando il software Image Pro versione 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (mediacy.com)). La microscopia elettronica a scansione è stata eseguita come descritto di seguito.
I batteri cresciuti durante la notte sono stati diluiti 1:100 in brodo Mueller-Hinton. 200 μl di coltura sono stati aggiunti a una membrana cicloporo sterile Whatman da 0,2 μm (Whatman, Maidstone, Regno Unito) e piastrati su agar Mueller-Hinton. Le piastre con il biofilm sono state incubate a 37°C per 72 ore per consentire la formazione di un biofilm maturo.
Dopo 3 giorni di maturazione del biofilm, una benda quadrata di 3 cm² è stata posizionata direttamente sul biofilm e incubata a 37 °C per 24 ore. Dopo aver rimosso la benda dalla superficie del biofilm, 1 ml di reagente PrestoBlue Cell Viability Reagent (Invitrogen, Waltham, MA) è stato aggiunto alla superficie di ciascun biofilm per 20 secondi. Le superfici sono state asciugate prima che i cambiamenti di colore venissero registrati utilizzando una fotocamera digitale Nikon D2300 (Nikon UK Ltd., Kingston, Regno Unito).
Preparare colture notturne su agar Mueller-Hinton, trasferire singole colonie in 10 ml di brodo Mueller-Hinton e incubare su agitatore a 37°C (100 rpm). Dopo l'incubazione notturna, la coltura è stata diluita 1:100 in brodo Mueller-Hinton e 300 µl sono stati depositati su una membrana circolare Whatman Cyclopore da 0,2 µm (Whatman International, Maidstone, Regno Unito) su agar Mueller-Hinton e incubati a 37°C entro 72 ore. Il biofilm maturo è stato applicato alla ferita come descritto di seguito.
Tutte le attività con animali sono state svolte presso l'Università di Manchester in base a una licenza di progetto approvata dall'Office of Animal Welfare and Ethical Review (P8721BD27) e in conformità con le linee guida pubblicate dall'Home Office ai sensi della revisione ASPA del 2012. Tutti gli autori hanno rispettato le linee guida di arrivo. Per tutti gli studi in vivo sono stati utilizzati topi C57BL/6j di otto settimane (Envigo, Oxon, Regno Unito). I topi sono stati anestetizzati con isoflurano (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, Regno Unito) e le loro superfici dorsali sono state rasate e pulite. A ciascun topo è stata quindi praticata una ferita escissionale di 2 × 6 mm utilizzando un punch per biopsia Stiefel (Schuco International, Hertfordshire, Regno Unito). Per le ferite infette da biofilm, applicare il biofilm coloniale di 72 ore cresciuto sulla membrana come descritto sopra allo strato dermico della ferita utilizzando un'ansa di inoculazione sterile immediatamente dopo la lesione e scartare la membrana. Un centimetro quadrato di medicazione è stato pre-inumidito con acqua sterile per mantenere un ambiente umido sulla ferita. Le medicazioni sono state applicate direttamente su ciascuna ferita e coperte con pellicola 3M Tegaderm (3M, Bracknell, Regno Unito) e adesivo liquido Mastisol (Eloquest Healthcare, Ferndale, MI) applicato attorno ai bordi per fornire ulteriore adesione. La buprenorfina (Animalcare, York, Regno Unito) è stata somministrata a una concentrazione di 0,1 mg/kg come analgesico. I topi sono stati soppressi tre giorni dopo l'infortunio utilizzando il metodo Schedule 1 e l'area della ferita è stata rimossa, divisa a metà e conservata secondo necessità.
La colorazione con ematossilina (ThermoFisher Scientific) ed eosina (ThermoFisher Scientific) è stata eseguita secondo il protocollo del produttore. L'area della ferita e la riepitelizzazione sono state quantificate utilizzando il software Image Pro versione 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
Le sezioni di tessuto sono state deparaffinate in xilene (ThermoFisher Scientific, Loughborough, Regno Unito), reidratate con etanolo a concentrazioni crescenti dal 100% al 50% e brevemente immerse in acqua deionizzata (ThermoFisher Scientific). L'immunocolorazione è stata eseguita utilizzando il kit VectaStain Elite ABC PK-6104 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) secondo il protocollo del produttore. Gli anticorpi primari per i neutrofili NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) e per i macrofagi Ms CD107b Pure M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, Regno Unito) sono stati diluiti 1:100 in soluzione bloccante e aggiunti alla superficie di taglio, seguiti da 2 anticorpi anti-, VectaStain ABC e dal kit di substrato Vector Nova Red Peroxidase (HRP) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) e controcolorati con ematossilina. Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio Olympus BX43 e una fotocamera digitale Olympus DP73 (Olympus, Southend-on-Sea, Regno Unito).
I campioni di cute sono stati fissati in glutaraldeide al 2,5% e formaldeide al 4% in HEPES 0,1 M (pH 7,4) per 24 ore a 4°C. I campioni sono stati disidratati con etanolo a concentrazione crescente e asciugati in CO2 utilizzando un essiccatore a punto critico Quorum K850 (Quorum Technologies Ltd, Loughton, Regno Unito) e rivestiti con una lega oro-palladio mediante un mini sputterer/sistema a scarica luminescente Quorum SC7620. I campioni sono stati osservati al microscopio elettronico a scansione FEI Quanta 250 (ThermoFisher Scientific) per visualizzare il punto centrale della ferita.
Toto-1 ioduro (2 μM) è stato applicato sulla superficie della ferita escissa del topo e incubato per 5 minuti a 37 °C (ThermoFisher Scientific) e trattato con Syto-60 (10 μM) a 37 °C (ThermoFisher Scientific). Sono state create immagini Z-stack di 15 minuti utilizzando un Leica TCS SP8.
I dati biologici e tecnici replicati sono stati tabulati e analizzati utilizzando il software Graphpad Prism V9 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Per verificare le differenze tra ciascun trattamento e la medicazione di controllo non antimicrobica è stata utilizzata l'analisi della varianza a una via con confronti multipli mediante il test post hoc di Dunnett. Un valore di p <0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
L'efficacia delle medicazioni fibrose in gel d'argento è stata inizialmente valutata contro le colonie di biofilm di Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa in vitro. Le medicazioni all'argento contengono diverse formulazioni di argento: le medicazioni tradizionali all'argento producono ioni Ag1+; le medicazioni all'argento, che possono produrre ioni Ag1+ dopo l'aggiunta di EDTA/BC, possono distruggere la matrice del biofilm ed esporre i batteri all'argento sotto l'effetto antibatterico degli ioni d'argento15 e le medicazioni contenenti sali di Ag ossigenati che producono ioni Ag1+, Ag2+ e Ag3+. La sua efficacia è stata confrontata con una medicazione di controllo non antimicrobica realizzata con fibre gelificate. I batteri vitali rimanenti all'interno del biofilm sono stati valutati ogni 24 ore per 8 giorni (Figura 1). Il giorno 5, il biofilm è stato reinoculato con 3,85 × 10⁵ S. Staphylococcus aureus o 1,22 × 10⁵ P. aeruginosa per valutare il recupero del biofilm. Rispetto alle medicazioni di controllo non antimicrobiche, le medicazioni Ag1+ hanno avuto un effetto minimo sulla vitalità batterica nei biofilm di Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa nell'arco di 5 giorni. Al contrario, le medicazioni contenenti Ag ossigenato e Ag1+ + sali di EDTA/BC sono risultate efficaci nell'uccidere i batteri all'interno del biofilm entro 5 giorni. Dopo ripetute inoculazioni con batteri planctonici al quinto giorno, non è stata osservata alcuna ricrescita del biofilm (Fig. 1).
Quantificazione dei batteri vitali nei biofilm di Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa dopo il trattamento con medicazioni all'argento. Colonie di biofilm di Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa sono state trattate con medicazioni all'argento o medicazioni di controllo non antimicrobiche e il numero di batteri vitali rimanenti è stato determinato ogni 24 ore. Dopo 5 giorni, il biofilm è stato reinoculato con 3,85×10⁵S. Staphylococcus aureus o 1,22×10⁵P. Colonie del batterioplancton Pseudomonas aeruginosa sono state formate individualmente per valutare il recupero del biofilm. I grafici mostrano la media +/- errore standard.
Per visualizzare l'effetto delle medicazioni a base di argento sulla vitalità del biofilm, le medicazioni sono state applicate a biofilm maturi cresciuti su pelle di maiale ex vivo. Dopo 24 ore, la medicazione è stata rimossa e il biofilm è stato colorato con un colorante reattivo blu, che viene metabolizzato dai batteri vivi in una colorazione rosa. I biofilm trattati con medicazioni di controllo erano rosa, indicando la presenza di batteri vitali all'interno del biofilm (Figura 2A). Al contrario, il biofilm trattato con la medicazione a base di Ag oxysol era prevalentemente blu, indicando che i batteri rimanenti sulla superficie della pelle del maiale erano batteri non vitali (Figura 2B). Una colorazione mista blu e rosa è stata osservata nei biofilm trattati con medicazioni contenenti Ag1+, indicando la presenza di batteri vitali e non vitali all'interno del biofilm (Figura 2C), mentre le medicazioni EDTA/BC contenenti Ag1+ erano prevalentemente blu con alcune macchie rosa, indicando le aree non interessate dalla medicazione a base di argento (Figura 2D). La quantificazione delle aree attive (rosa) e inattive (blu) ha mostrato che la patch di controllo era attiva al 75% (Figura 2E). Le medicazioni Ag1+ + EDTA/BC hanno avuto un comportamento simile alle medicazioni con sali d'argento ossigenati, con tassi di sopravvivenza rispettivamente del 13% e del 14%. La medicazione Ag1+ ha anche ridotto la vitalità batterica del 21%. Questi biofilm sono stati quindi osservati mediante microscopia elettronica a scansione (SEM). Dopo il trattamento con la medicazione di controllo e la medicazione Ag1+, è stato osservato uno strato di Pseudomonas aeruginosa che ricopriva la pelle suina (Figura 2F,H), mentre dopo il trattamento con la medicazione Ag1+, sono state trovate poche cellule batteriche e poche cellule batteriche sono state trovate al di sotto. Le fibre di collagene possono essere considerate come la struttura tissutale della pelle suina (Figura 2G). Dopo il trattamento con la medicazione Ag1+ + EDTA/BC, erano visibili placche batteriche e placche di fibre di collagene sottostanti (Figura 2I).
Visualizzazione del biofilm di Pseudomonas aeruginosa dopo il trattamento con medicazioni all'argento. (A–D) La vitalità batterica nei biofilm di Pseudomonas aeruginosa cresciuti su pelle di maiale è stata visualizzata utilizzando il colorante di vitalità PrestoBlue 24 ore dopo il trattamento con medicazioni all'argento o medicazioni di controllo non antimicrobiche. I batteri vivi sono rosa, i batteri non vitali e la pelle di maiale sono blu. (E) Quantificazione dei biofilm di Pseudomonas aeruginosa cresciuti su pelle di maiale (punto rosa) utilizzando la microscopia elettronica a scansione Image Pro versione 10 (FI) e trattati con una medicazione all'argento o una medicazione di controllo non antimicrobica per 24 ore. Scala SEM = 5 µm. (J–M) I biofilm coloniali sono cresciuti su filtri e sono stati colorati con il colorante reattivo PrestoBlue dopo 24 ore di incubazione con medicazioni all'argento.
Per determinare se lo stretto contatto tra le medicazioni e i biofilm influenzasse l'efficacia delle medicazioni stesse, i biofilm coloniali posti su una superficie piana sono stati trattati con le medicazioni per 24 ore e successivamente colorati con coloranti reattivi. Il biofilm non trattato presentava una colorazione rosa scuro (Figura 2J). Al contrario dei biofilm trattati con medicazioni contenenti sali di Ag ossigenati (Figura 2K), i biofilm trattati con medicazioni contenenti Ag1+ o Ag1+ + EDTA/BC mostravano bande di colorazione rosa (Figura 2L,M). Questa colorazione rosa indica la presenza di batteri vitali ed è associata all'area di sutura all'interno della medicazione. Queste aree cucite creano spazi morti che consentono ai batteri all'interno del biofilm di sopravvivere.
Per valutare l'efficacia delle medicazioni a base di argento in vivo, ferite a tutto spessore escisse da topi infettati con biofilm maturi di S. aureus e P. aeruginosa sono state trattate con medicazioni di controllo non antimicrobiche o con medicazioni a base di argento. Dopo 3 giorni di trattamento, l'analisi macroscopica delle immagini ha mostrato dimensioni delle ferite inferiori quando trattate con medicazioni a base di sale ossigenato rispetto alle medicazioni di controllo non antimicrobiche e alle altre medicazioni a base di argento (Figura 3A-H). Per confermare queste osservazioni, le ferite sono state prelevate e l'area della ferita e la riepitelizzazione sono state quantificate su sezioni di tessuto colorate con ematossilina ed eosina utilizzando il software Image Pro versione 10 (Figura 3I-L).
Effetto delle medicazioni all'argento sulla superficie della ferita e sulla riepitelizzazione delle ferite infette da biofilm. (A–H) Piccole cellule infette da biofilm di Pseudomonas aeruginosa (A–D) e Staphylococcus aureus (E–H) dopo tre giorni di trattamento con una medicazione di controllo non antimicrobica, una medicazione con sale d'argento ossigenato, una medicazione Ag1+ e una medicazione Ag1+. Immagini macroscopiche rappresentative. Ferite di topi con medicazione Ag1+ + EDTA/BC. (IL) Infezione rappresentativa da Pseudomonas aeruginosa, sezioni istologiche colorate con ematossilina ed eosina, utilizzate per quantificare l'area della ferita e la rigenerazione epiteliale. Quantificazione dell'area della ferita (M, O) e percentuale di riepitelizzazione (N, P) di ferite infette da biofilm di Pseudomonas aeruginosa (M, N) e Staphylococcus aureus (O, P) (per gruppo di trattamento n = 12). I grafici mostrano la media +/- errore standard. * indica p = < 0,05 ** indica p = < 0,01; Scala macroscopica = 2,5 mm, scala istologica = 500 µm.
La quantificazione dell'area della ferita nelle ferite infette da biofilm di Pseudomonas aeruginosa (Figura 3M) ha mostrato che le ferite trattate con ossisali di Ag avevano una dimensione media della ferita di 2,5 mm2, mentre la medicazione di controllo non antimicrobica aveva una dimensione media della ferita di 3,1 mm2, il che non è vero. ha raggiunto la significatività statistica (Figura 3M). p = 0,423). Le ferite trattate con Ag1+ o Ag1+ + EDTA/BC non hanno mostrato alcuna riduzione dell'area della ferita (3,1 mm2 e 3,6 mm2, rispettivamente). Il trattamento con medicazione a base di sali di Ag ossigenati ha promosso la riepitelizzazione in misura maggiore rispetto alla medicazione di controllo non antimicrobica (34% e 15%, rispettivamente; p = 0,029) e Ag1+ o Ag1+ + EDTA/BC (10% e 11%) (Figura 3N). , rispettivamente.
Tendenze simili nell'area della ferita e nella rigenerazione epiteliale sono state osservate nelle ferite infette da biofilm di S. aureus (Figura 3O). Le medicazioni contenenti sali d'argento ossigenati hanno ridotto l'area della ferita (2,0 mm2) del 23% rispetto alla medicazione di controllo non antimicrobica (2,6 mm2), sebbene questa riduzione non fosse significativa (p = 0,304) (Fig. 3O). Inoltre, l'area della ferita nel gruppo di trattamento Ag1+ è risultata leggermente ridotta (2,4 mm2), mentre la ferita trattata con la medicazione Ag1+ + EDTA/BC non ha ridotto l'area della ferita (2,9 mm2). I sali di Ag ossigenati hanno anche promosso la riepitelizzazione delle ferite infette da biofilm di S. aureus (31%) in misura maggiore rispetto a quelle trattate con medicazioni di controllo non antimicrobiche (12%, p = 0,003) (Figura 3P). La medicazione Ag1+ (16%, p = 0,903) e la medicazione Ag+1 + EDTA/BC (14%, p = 0,965) hanno mostrato livelli di rigenerazione epiteliale simili al controllo.
Per visualizzare l'effetto delle medicazioni all'argento sulla matrice del biofilm, è stata eseguita la colorazione con ioduro di Toto 1 e Syto 60 (Fig. 4). Lo ioduro di Toto 1 è un colorante impermeabile alle cellule che può essere utilizzato per visualizzare accuratamente gli acidi nucleici extracellulari, che sono abbondanti nell'EPS dei biofilm. Syto 60 è un colorante permeabile alle cellule utilizzato come controcolorante16. Le osservazioni dello ioduro di Toto 1 e Syto 60 in ferite inoculate con biofilm di Pseudomonas aeruginosa (Figura 4A-D) e Staphylococcus aureus (Figura 4I-L) hanno mostrato che dopo 3 giorni di trattamento con medicazione, l'EPS nel biofilm era significativamente ridotto. contenente sali ossigenati Ag e Ag1+ + EDTA/BC. Le medicazioni Ag1+ senza componenti antibiofilm aggiuntivi hanno ridotto significativamente il DNA libero nelle ferite inoculate con Pseudomonas aeruginosa, ma sono risultate meno efficaci nelle ferite inoculate con Staphylococcus aureus.
Immagini in vivo del biofilm della ferita dopo 3 giorni di trattamento con medicazioni di controllo o all'argento. Immagini confocali di Pseudomonas aeruginosa (A–D) e Staphylococcus aureus (I–L) colorate con Toto 1 (verde) per visualizzare gli acidi nucleici extracellulari, un componente dei polimeri del biofilm extracellulare. Per colorare gli acidi nucleici intracellulari, utilizzare Syto 60 (rosso). P. Microscopia elettronica a scansione di ferite infette da biofilm di Pseudomonas aeruginosa (E–H) e Staphylococcus aureus (M–P) dopo 3 giorni di trattamento con medicazioni di controllo e all'argento. Scala SEM = 5 µm. Scala di imaging confocale = 50 µm.
La microscopia elettronica a scansione ha mostrato che i topi inoculati con colonie di biofilm di Pseudomonas aeruginosa (Figura 4E-H) e Staphylococcus aureus (Figura 4M-P) presentavano un numero significativamente inferiore di batteri nelle ferite dopo 3 giorni di trattamento con tutte le medicazioni a base di argento.
Per valutare l'effetto delle medicazioni all'argento sull'infiammazione delle ferite in topi infetti da biofilm, sezioni di ferite infette da biofilm trattate con medicazioni di controllo o all'argento per 3 giorni sono state colorate immunoistochimicamente utilizzando anticorpi specifici per neutrofili e macrofagi. Determinazione quantitativa di neutrofili e macrofagi internamente. tessuto di granulazione. Figura 5). Tutte le medicazioni all'argento hanno ridotto il numero di neutrofili e macrofagi nelle ferite infette da Pseudomonas aeruginosa rispetto alle medicazioni di controllo non antimicrobiche dopo tre giorni di trattamento. Tuttavia, il trattamento con la medicazione a base di sale d'argento ossigenato ha determinato una maggiore riduzione di neutrofili (p = <0,0001) e macrofagi (p = <0,0001) rispetto alle altre medicazioni all'argento testate (Figura 5I,J). Sebbene Ag1+ + EDTA/BC abbia avuto un effetto maggiore sul biofilm della ferita, ha ridotto i livelli di neutrofili e macrofagi in misura minore rispetto alla medicazione Ag1+. Sono state osservate anche ferite moderate infette da biofilm di S. aureus dopo medicazione con oxisol di Ag (p = <0,0001), Ag1+ (p = 0,0008) e Ag1++ EDTA/BC (p = 0,0043) rispetto al controllo. Tendenze simili sono osservate per la neutropenia. bendaggio (Fig. 5K). Tuttavia, solo la medicazione con sale di Ag ossigenato ha mostrato una riduzione significativa del numero di macrofagi nel tessuto di granulazione rispetto al controllo nelle ferite infette da biofilm di S. aureus (p = 0,0339) (Figura 5L).
I neutrofili e i macrofagi sono stati quantificati in ferite infette da biofilm di Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus dopo 3 giorni di trattamento con medicazioni di controllo non antimicrobiche o medicazioni all'argento. I neutrofili (AD) e i macrofagi (EH) sono stati quantificati in sezioni di tessuto colorate con anticorpi specifici per i neutrofili o i macrofagi. Quantificazione dei neutrofili (I e K) e dei macrofagi (J e L) in ferite infette da biofilm di Pseudomonas aeruginosa (I e J) e Staphylococcus aureus (K e L). N = 12 per gruppo. I grafici mostrano la media +/- errore standard, i valori di significatività rispetto alla medicazione di controllo non antibatterica, * significa p = < 0,05, ** significa p = < 0,01; *** significa p = < 0,001; indica p = <0,0001).
Abbiamo quindi valutato l'effetto delle medicazioni a base di argento sulla guarigione indipendente dall'infezione. Le ferite escissionali non infette sono state trattate con una medicazione di controllo non antimicrobica o con una medicazione a base di argento per 3 giorni (Figura 6). Tra le medicazioni a base di argento testate, solo le ferite trattate con la medicazione a base di sale ossigenato sono apparse più piccole nelle immagini macroscopiche rispetto alle ferite trattate con il controllo (Figura 6A-D). La quantificazione dell'area della ferita mediante analisi istologica ha mostrato che l'area media della ferita dopo il trattamento con la medicazione Ag oxysols era di 2,35 mm2 rispetto a 2,96 mm2 per le ferite trattate con il gruppo di controllo, ma questa differenza non ha raggiunto la significatività statistica (p = 0,488) (Fig. 6I). Al contrario, non è stata osservata alcuna riduzione dell'area della ferita dopo il trattamento con le medicazioni Ag1+ (3,38 mm2, p = 0,757) o Ag1+ + EDTA/BC (4,18 mm2, p = 0,054) rispetto al gruppo di controllo. È stata osservata una maggiore rigenerazione epiteliale con la medicazione Ag oxysol rispetto al gruppo di controllo (30% contro 22%, rispettivamente), sebbene ciò non abbia raggiunto la significatività statistica (p = 0,067), è comunque abbastanza significativo e conferma i risultati precedenti. Una medicazione con oxysol promuove la riepitelizzazione. -Epitelizzazione di ferite non infette17. Al contrario, il trattamento con medicazioni Ag1+ o Ag1+ + EDTA/BC non ha avuto alcun effetto o ha mostrato una ridotta riepitelizzazione rispetto al controllo.
Effetto della medicazione a base di argento sulla guarigione delle ferite in topi non infetti sottoposti a resezione completa. (AD) Immagini macroscopiche rappresentative delle ferite dopo tre giorni di trattamento con una medicazione di controllo non antimicrobica e una medicazione a base di argento. (EH) Sezioni rappresentative delle ferite colorate con ematossilina ed eosina. La quantificazione dell'area della ferita (I) e della percentuale di riepitelizzazione (J) è stata calcolata da sezioni istologiche al punto medio della ferita utilizzando un software di analisi delle immagini (n = 11-12 per gruppo di trattamento). I grafici mostrano la media +/- errore standard. * indica p = <0,05.
L'argento ha una lunga storia di utilizzo come terapia antimicrobica nella guarigione delle ferite, ma le numerose formulazioni e i metodi di somministrazione diversi possono comportare differenze nell'efficacia antimicrobica 18. Inoltre, le proprietà antibiofilm di specifici sistemi di somministrazione dell'argento non sono ancora del tutto comprese. Sebbene la risposta immunitaria dell'ospite sia relativamente efficace contro i batteri planctonici, è generalmente meno efficace contro i biofilm19. I batteri planctonici vengono facilmente fagocitati dai macrofagi, ma all'interno dei biofilm, le cellule aggregate pongono ulteriori problemi limitando la risposta dell'ospite al punto che le cellule immunitarie possono andare incontro ad apoptosi e rilasciare fattori proinfiammatori per potenziare la risposta immunitaria20. È stato osservato che alcuni leucociti possono penetrare i biofilm21 ma non sono in grado di fagocitare i batteri una volta che questa difesa è compromessa22. È necessario utilizzare un approccio olistico per supportare la risposta immunitaria dell'ospite contro l'infezione da biofilm della ferita. Lo sbrigliamento della ferita può disgregare fisicamente il biofilm e rimuovere la maggior parte del carico batterico, ma la risposta immunitaria dell'ospite potrebbe risultare inefficace contro il biofilm residuo, soprattutto se compromessa. Pertanto, terapie antimicrobiche come le medicazioni a base di argento possono supportare la risposta immunitaria dell'ospite ed eliminare le infezioni da biofilm. Composizione, concentrazione, solubilità e substrato di rilascio possono influenzare l'efficacia antimicrobica dell'argento. Negli ultimi anni, i progressi nella tecnologia di lavorazione dell'argento hanno reso queste medicazioni più efficaci9,23. Con l'avanzare della tecnologia delle medicazioni a base di argento, è importante comprenderne l'efficacia nel controllo delle infezioni delle ferite e, soprattutto, l'impatto di queste potenti forme di argento sull'ambiente della ferita e sulla guarigione.
In questo studio, abbiamo confrontato l'efficacia di due medicazioni avanzate a base di argento con medicazioni convenzionali a base di argento che producono ioni Ag1+ contro i biofilm, utilizzando diversi modelli in vitro e in vivo. Abbiamo anche valutato l'effetto di queste medicazioni sull'ambiente della ferita e sulla guarigione indipendente dall'infezione. Per minimizzare l'influenza della matrice di rilascio, tutte le medicazioni a base di argento testate erano composte da carbossimetilcellulosa.
La nostra valutazione preliminare di queste medicazioni a base di argento contro i biofilm coloniali di Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus mostra che, a differenza delle tradizionali medicazioni Ag1+, due medicazioni avanzate a base di argento, Ag1+ + EDTA/BC e sali di Ag ossigenati, sono efficaci nell'uccidere i batteri del biofilm in pochi giorni. Inoltre, queste medicazioni prevengono la riformazione del biofilm in seguito a ripetute esposizioni a batteri planctonici. La medicazione Ag1+ conteneva cloruro d'argento, lo stesso composto d'argento e la stessa matrice di base di Ag1+ + EDTA/BC, e ha avuto un effetto limitato sulla vitalità batterica all'interno del biofilm nello stesso periodo. L'osservazione che una medicazione Ag1+ + EDTA/BC fosse più efficace contro il biofilm rispetto a una medicazione Ag1+ composta dalla stessa matrice e da un composto d'argento supporta l'idea che siano necessari ingredienti aggiuntivi per aumentare l'efficacia del cloruro d'argento contro il biofilm, come riportato altrove15. Questi risultati supportano l'idea che BC ed EDTA svolgano un ruolo aggiuntivo contribuendo all'efficacia complessiva della medicazione e che l'assenza di questo componente nelle medicazioni Ag1+ possa aver contribuito alla mancata dimostrazione di efficacia in vitro. Abbiamo riscontrato che le medicazioni a base di sali d'argento ossigenati che producono ioni Ag2+ e Ag3+ hanno mostrato una maggiore efficacia antibatterica rispetto ad Ag1+ e a livelli simili a quelli di Ag1+ + EDTA/BC. Tuttavia, a causa dell'elevato potenziale redox, non è chiaro per quanto tempo gli ioni Ag3+ rimangano attivi ed efficaci contro i biofilm delle ferite e pertanto meritano ulteriori studi. Inoltre, esistono molte medicazioni diverse che generano ioni Ag1+ che non sono state testate in questo studio. Queste medicazioni sono composte da diversi composti d'argento, concentrazioni e matrici di base, che possono influenzare il rilascio di ioni Ag1+ e la loro efficacia contro i biofilm. Vale anche la pena notare che esistono molti modelli in vitro e in vivo diversi utilizzati per valutare l'efficacia delle medicazioni per ferite contro i biofilm. Il tipo di modello utilizzato, così come il contenuto di sale e proteine dei terreni di coltura impiegati, influenzeranno l'efficacia della medicazione. Nel nostro modello in vivo, abbiamo permesso al biofilm di maturare in vitro e successivamente lo abbiamo trasferito sulla superficie dermica della ferita. La risposta immunitaria del topo ospite è relativamente efficace contro i batteri planctonici applicati alla ferita, favorendo così la formazione di un biofilm durante il processo di guarigione. L'aggiunta di biofilm maturo a una ferita limita l'efficacia della risposta immunitaria dell'ospite alla formazione del biofilm, consentendo al biofilm maturo di insediarsi all'interno della ferita prima che possa iniziare la guarigione. Pertanto, il nostro modello ci permette di valutare l'efficacia delle medicazioni antimicrobiche sui biofilm maturi prima che le ferite inizino a guarire.
Abbiamo anche scoperto che l'aderenza della medicazione influenzava l'efficacia delle medicazioni a base di argento sui biofilm coltivati in vitro e sulla pelle di suino. Il contatto ravvicinato con la ferita è considerato fondamentale per l'efficacia antimicrobica della medicazione24,25. Le medicazioni contenenti sali di Ag ossigenati erano a stretto contatto con i biofilm maturi, determinando una significativa riduzione del numero di batteri vitali all'interno del biofilm dopo 24 ore. Al contrario, quando trattate con medicazioni Ag1+ e Ag1+ + EDTA/BC, un numero significativo di batteri vitali rimaneva. Queste medicazioni contengono suture lungo tutta la loro lunghezza, che creano spazi morti che impediscono il contatto ravvicinato con il biofilm. Nei nostri studi in vitro, queste aree non a contatto hanno impedito l'uccisione dei batteri vitali all'interno del biofilm. Abbiamo valutato la vitalità batterica solo dopo 24 ore di trattamento; col passare del tempo, man mano che la medicazione si satura, potrebbero esserci meno spazi morti, riducendo l'area disponibile per questi batteri vitali. Tuttavia, ciò evidenzia l'importanza della composizione della medicazione, non solo del tipo di argento in essa contenuto.
Sebbene gli studi in vitro siano utili per confrontare l'efficacia di diverse tecnologie a base di argento, è altrettanto importante comprendere gli effetti di queste medicazioni sui biofilm in vivo, dove i tessuti dell'ospite e le risposte immunitarie contribuiscono all'efficacia delle medicazioni contro i biofilm. L'effetto di queste medicazioni sui biofilm delle ferite è stato osservato mediante microscopia elettronica a scansione e colorazione EPS del biofilm utilizzando coloranti per il DNA intracellulare ed extracellulare. Abbiamo riscontrato che, dopo 3 giorni di trattamento, tutte le medicazioni erano efficaci nel ridurre il DNA libero circolante nelle ferite infette da biofilm, ma la medicazione Ag1+ era meno efficace nelle ferite infette da Staphylococcus aureus. La microscopia elettronica a scansione ha anche mostrato una quantità significativamente inferiore di batteri presenti nelle ferite trattate con le medicazioni a base di argento, sebbene questo effetto fosse più pronunciato con la medicazione a base di sale d'argento ossigenato e la medicazione Ag1+ + EDTA/BC rispetto alla medicazione Ag1+. Questi dati dimostrano che le medicazioni a base di argento testate hanno avuto un impatto variabile sulla struttura del biofilm, ma nessuna di esse è stata in grado di eradicare completamente il biofilm, a supporto della necessità di un approccio olistico al trattamento delle infezioni da biofilm delle ferite; l'uso di fasce d'argento per le braccia. Il trattamento è preceduto da uno sbrigliamento fisico per rimuovere la maggior parte del biofilm.
Le ferite croniche sono spesso in uno stato di grave infiammazione, con un eccesso di cellule infiammatorie che permangono nel tessuto della ferita per un periodo prolungato, causando danni tissutali e riducendo l'ossigeno necessario per un metabolismo e una funzione cellulare efficienti nella ferita26. I biofilm aggravano questo ambiente ostile della ferita influenzando negativamente la guarigione in diversi modi, tra cui l'inibizione della proliferazione e della migrazione cellulare e l'attivazione di citochine proinfiammatorie27. Poiché le medicazioni a base di argento stanno diventando sempre più efficaci, è importante comprenderne l'impatto sull'ambiente della ferita e sulla guarigione.
È interessante notare che, sebbene tutte le medicazioni a base di argento abbiano influenzato la composizione del biofilm, solo le medicazioni a base di sali d'argento ossigenati hanno aumentato la riepitelizzazione di queste ferite infette. Questi dati supportano i nostri risultati precedenti17 e quelli di Kalan et al. (2017)28, che hanno dimostrato buoni profili di sicurezza e tossicità dei sali d'argento ossigenati, poiché concentrazioni inferiori di argento si sono rivelate efficaci contro i biofilm.
Il nostro studio attuale evidenzia le differenze nella tecnologia dell'argento tra le medicazioni antimicrobiche a base di argento e l'impatto di questa tecnologia sull'ambiente della ferita e sulla guarigione indipendente dall'infezione. Tuttavia, questi risultati differiscono da studi precedenti che mostravano che la medicazione Ag1+ + EDTA/BC migliorava i parametri di guarigione delle orecchie di coniglio lesionate in vivo. Tuttavia, ciò potrebbe essere dovuto a differenze nei modelli animali, nei tempi di misurazione e nei metodi di applicazione batterica29. In questo caso, le misurazioni della ferita sono state effettuate 12 giorni dopo la lesione per consentire ai principi attivi della medicazione di agire sul biofilm per un periodo di tempo più lungo. Ciò è supportato da uno studio che ha mostrato che le ulcere della gamba clinicamente infette trattate con Ag1+ + EDTA/BC inizialmente aumentavano di dimensioni dopo una settimana di trattamento, e poi nelle successive 3 settimane di trattamento con Ag1+ + EDTA/BC ed entro 4 settimane dall'uso di farmaci non antimicrobici. medicazioni CMC per ridurre le dimensioni delle ulcere30.
È stato precedentemente dimostrato che alcune forme e concentrazioni di argento sono citotossiche in vitro¹¹, ma questi risultati in vitro non sempre si traducono in effetti avversi in vivo. Inoltre, i progressi nella tecnologia dell'argento e una migliore comprensione dei composti e delle concentrazioni di argento nelle medicazioni hanno portato allo sviluppo di molte medicazioni all'argento sicure ed efficaci. Tuttavia, con l'avanzare della tecnologia delle medicazioni all'argento, è importante comprendere l'impatto di queste medicazioni sull'ambiente della ferita³¹,³²,³³. È stato precedentemente riportato che l'aumento del tasso di riepitelizzazione corrisponde a una maggiore proporzione di macrofagi M2 antinfiammatori rispetto al fenotipo M1 proinfiammatorio. Ciò è stato osservato in un precedente modello murino in cui le medicazioni per ferite a base di idrogel d'argento sono state confrontate con sulfadiazina d'argento e idrogel non antimicrobici³⁴.
Le ferite croniche possono presentare un'infiammazione eccessiva ed è stato osservato che la presenza di un eccesso di neutrofili può essere dannosa per la guarigione delle ferite35. In uno studio su topi con deplezione di neutrofili, la presenza di neutrofili ha ritardato la riepitelizzazione. La presenza di un eccesso di neutrofili porta ad alti livelli di proteasi e specie reattive dell'ossigeno, come il superossido e il perossido di idrogeno, che sono associati a ferite croniche e a lenta guarigione37,38. Allo stesso modo, un aumento del numero di macrofagi, se incontrollato, può portare a un ritardo nella guarigione delle ferite39. Questo aumento è particolarmente importante se i macrofagi non sono in grado di passare da un fenotipo pro-infiammatorio a un fenotipo pro-guarigione, con conseguente mancata uscita delle ferite dalla fase infiammatoria della guarigione40. Abbiamo osservato una diminuzione di neutrofili e macrofagi nelle ferite infette da biofilm dopo 3 giorni di trattamento con tutte le medicazioni a base di argento, ma la diminuzione è stata più pronunciata con le medicazioni a base di sale ossigenato. Questa diminuzione può essere una conseguenza diretta della risposta immunitaria all'argento, una risposta alla riduzione del carico batterico o il fatto che la ferita si trovi in una fase più avanzata di guarigione e, di conseguenza, che le cellule immunitarie nella ferita siano ridotte. Ridurre il numero di cellule infiammatorie nella ferita può mantenere un ambiente favorevole alla guarigione. Il meccanismo d'azione con cui gli ossisali di Ag promuovono la guarigione indipendente dall'infezione non è chiaro, ma la capacità degli ossisali di Ag di produrre ossigeno e distruggere livelli dannosi di perossido di idrogeno, un mediatore dell'infiammazione, potrebbe spiegarlo e richiede ulteriori studi17.
Le ferite infette croniche che non guariscono rappresentano un problema sia per i medici che per i pazienti. Sebbene molte medicazioni rivendichino un'efficacia antimicrobica, la ricerca raramente si concentra su altri fattori chiave che influenzano il microambiente della ferita. Questo studio dimostra che diverse tecnologie a base di argento presentano un'efficacia antimicrobica differente e, soprattutto, effetti diversi sull'ambiente della ferita e sulla guarigione, indipendentemente dall'infezione. Sebbene questi studi in vitro e in vivo dimostrino l'efficacia di queste medicazioni nel trattamento delle infezioni delle ferite e nella promozione della guarigione, sono necessari studi clinici randomizzati e controllati per valutarne l'efficacia nella pratica clinica.
I set di dati utilizzati e/o analizzati nel corso del presente studio sono disponibili presso l'autore corrispondente su richiesta motivata.
Data di pubblicazione: 15 luglio 2024