Grazie per aver visitato Nature.com. La versione del browser che stai utilizzando ha un supporto CSS limitato. Per ottenere risultati ottimali, ti consigliamo di utilizzare un browser più recente (o di disattivare la modalità compatibilità in Internet Explorer). Nel frattempo, per garantire un supporto continuo, visualizzeremo il sito senza stili e JavaScript.
La creazione di modelli animali di cambiamento modico (MC) è una base importante per lo studio della MC. Cinquantaquattro conigli bianchi della Nuova Zelanda sono stati divisi in gruppo di operazione simulata, gruppo di impianto muscolare (gruppo ME) e gruppo di impianto di nucleo polposo (gruppo NPE). Nel gruppo NPE, il disco intervertebrale è stato esposto mediante approccio chirurgico lombare anterolaterale ed è stato utilizzato un ago per forare il corpo vertebrale L5 vicino alla placca terminale. NP è stato estratto dal disco intervertebrale L1/2 mediante una siringa e iniettato al suo interno. Praticare un foro nell'osso subcondrale. Le procedure chirurgiche e i metodi di perforazione nel gruppo di impianto muscolare e nel gruppo di operazioni fittizie erano gli stessi del gruppo di impianto NP. Nel gruppo ME, un pezzo di muscolo è stato inserito nel foro, mentre nel gruppo con operazione simulata non è stato inserito nulla nel foro. Dopo l'operazione sono stati eseguiti la risonanza magnetica e i test di biologia molecolare. Il segnale nel gruppo NPE è cambiato, ma non c'è stato alcun evidente cambiamento del segnale nel gruppo dell'operazione simulata e nel gruppo ME. L'osservazione istologica ha mostrato che è stata osservata una proliferazione anomala del tessuto nel sito di impianto e l'espressione di IL-4, IL-17 e IFN-γ era aumentata nel gruppo NPE. L'impianto di NP nell'osso subcondrale può formare un modello animale di MC.
I cambiamenti modici (MC) sono lesioni delle placche vertebrali e del midollo osseo adiacente visibili alla risonanza magnetica (MRI). Sono abbastanza comuni negli individui con sintomi associati1. Molti studi hanno sottolineato l’importanza del MC a causa della sua associazione con la lombalgia (LBP)2,3. de Roos et al.4 e Modic et al.5 hanno descritto per primi indipendentemente tre diversi tipi di anomalie del segnale subcondrale nel midollo osseo vertebrale. Le alterazioni modiche di tipo I sono ipointense nelle sequenze pesate in T1 (T1W) e iperintense nelle sequenze pesate in T2 (T2W). Questa lesione rivela placche terminali della fessura e tessuto di granulazione vascolare adiacente nel midollo osseo. Le modifiche modiche di tipo II mostrano un segnale elevato su entrambe le sequenze T1W e T2W. In questo tipo di lesione si può riscontrare la distruzione della placca terminale e la sostituzione istologica di grasso del midollo osseo adiacente. Le modifiche modiche di tipo III mostrano un segnale basso nelle sequenze T1W e T2W. Sono state osservate lesioni sclerotiche corrispondenti alle placche terminali6. La MC è considerata una malattia patologica della colonna vertebrale ed è strettamente associata a molte malattie degenerative della colonna vertebrale7,8,9.
Considerando i dati disponibili, diversi studi hanno fornito approfondimenti dettagliati sull’eziologia e sui meccanismi patologici della MC. Albert et al. ha suggerito che la MC potrebbe essere causata dall'ernia del disco8. Hu et al. attribuito MC a grave degenerazione del disco10. Kroc ha proposto il concetto di “rottura del disco interno”, in cui si afferma che traumi ripetuti del disco possono portare a microlesioni nella placca terminale. Dopo la formazione della fessura, la distruzione della placca terminale da parte del nucleo polposo (NP) può innescare una risposta autoimmune, che porta ulteriormente allo sviluppo di MC11. Ma et al. hanno condiviso una visione simile e hanno riferito che l'autoimmunità indotta da NP gioca un ruolo chiave nella patogenesi dell'MC12.
Le cellule del sistema immunitario, in particolare i linfociti T helper CD4+, svolgono un ruolo fondamentale nella patogenesi dell'autoimmunità13. Il sottoinsieme Th17 scoperto di recente produce la citochina proinfiammatoria IL-17, promuove l'espressione delle chemochine e stimola le cellule T negli organi danneggiati a produrre IFN-γ14. Le cellule Th2 svolgono anche un ruolo unico nella patogenesi delle risposte immunitarie. L'espressione di IL-4 come cellula Th2 rappresentativa può portare a gravi conseguenze immunopatologiche15.
Sebbene siano stati condotti molti studi clinici su MC16,17,18,19,20,21,22,23,24, mancano ancora modelli sperimentali animali adatti che possano imitare il processo MC che si verifica frequentemente negli esseri umani e che possa essere utilizzato per indagare l'eziologia o nuovi trattamenti come la terapia mirata. Ad oggi, solo pochi modelli animali di MC sono stati segnalati per studiare i meccanismi patologici sottostanti.
Basato sulla teoria autoimmune proposta da Albert e Ma, questo studio ha stabilito un modello MC di coniglio semplice e riproducibile mediante autotrapianto di NP vicino alla piastra terminale vertebrale forata. Altri obiettivi sono osservare le caratteristiche istologiche dei modelli animali e valutare i meccanismi specifici di NP nello sviluppo di MC. A tal fine, utilizziamo tecniche come la biologia molecolare, la risonanza magnetica e gli studi istologici per studiare la progressione della MC.
Due conigli sono morti per emorragia durante l'intervento chirurgico e quattro conigli sono morti durante l'anestesia durante la risonanza magnetica. I restanti 48 conigli sopravvissero e non mostrarono segni comportamentali o neurologici dopo l'intervento.
La risonanza magnetica mostra che l'intensità del segnale del tessuto incorporato nei diversi fori è diversa. L'intensità del segnale del corpo vertebrale L5 nel gruppo NPE è cambiata gradualmente a 12, 16 e 20 settimane dopo l'inserimento (la sequenza T1W ha mostrato un segnale basso e la sequenza T2W ha mostrato un segnale misto più un segnale basso) (Fig. 1C), mentre le apparenze della MRI degli altri due gruppi di parti incastonate sono rimasti relativamente stabili durante lo stesso periodo (Fig. 1A, B).
(A) MRI sequenziali rappresentative della colonna lombare del coniglio in 3 punti temporali. Non sono state riscontrate anomalie di segnale nelle immagini del gruppo sottoposto ad operazione fittizia. (B) Le caratteristiche del segnale del corpo vertebrale nel gruppo ME sono simili a quelle del gruppo con operazione simulata e nel tempo non si osserva alcun cambiamento significativo del segnale nel sito di inclusione. (C) Nel gruppo NPE, il segnale basso è chiaramente visibile nella sequenza T1W e il segnale misto e il segnale basso sono chiaramente visibili nella sequenza T2W. Dal periodo di 12 settimane al periodo di 20 settimane, i segnali alti sporadici che circondano i segnali bassi nella sequenza T2W diminuiscono.
È possibile osservare un'evidente iperplasia ossea nel sito di impianto del corpo vertebrale nel gruppo NPE e l'iperplasia ossea si verifica più velocemente da 12 a 20 settimane (Fig. 2C) rispetto al gruppo NPE, non si osserva alcun cambiamento significativo nel modello vertebrale corpi; Gruppo finto e gruppo ME (Fig. 2C) 2A,B).
(A) La superficie del corpo vertebrale nella porzione impiantata è molto liscia, il foro guarisce bene e non è presente iperplasia nel corpo vertebrale. (B) La forma del sito impiantato nel gruppo ME è simile a quella del gruppo con operazione simulata e non vi è alcun cambiamento evidente nell'aspetto del sito impiantato nel tempo. (C) L'iperplasia ossea si è verificata nel sito impiantato nel gruppo NPE. L'iperplasia ossea aumentava rapidamente e si estendeva anche attraverso il disco intervertebrale al corpo vertebrale controlaterale.
L'analisi istologica fornisce informazioni più dettagliate sulla formazione ossea. La Figura 3 mostra le fotografie delle sezioni postoperatorie colorate con H&E. Nel gruppo con operazione simulata, i condrociti erano ben disposti e non è stata rilevata alcuna proliferazione cellulare (Fig. 3A). La situazione nel gruppo ME era simile a quella del gruppo con operazione simulata (Fig. 3B). Tuttavia, nel gruppo NPE, nel sito di impianto è stato osservato un gran numero di condrociti e una proliferazione di cellule simili a NP (Fig. 3C);
(A) Le trabecole possono essere viste vicino alla piastra terminale, i condrociti sono disposti ordinatamente con dimensioni e forma cellulare uniformi e nessuna proliferazione (40 volte). (B) La condizione del sito di impianto nel gruppo ME è simile a quella del gruppo fittizio. Si possono osservare trabecole e condrociti, ma non vi è alcuna proliferazione evidente nel sito di impianto (40 volte). (B) Si può vedere che i condrociti e le cellule simili a NP proliferano in modo significativo e la forma e la dimensione dei condrociti non sono uniformi (40 volte).
L’espressione dell’mRNA dell’interleuchina 4 (IL-4), dell’mRNA dell’interleuchina 17 (IL-17) e dell’interferone γ (IFN-γ) è stata osservata in entrambi i gruppi NPE e ME. Quando sono stati confrontati i livelli di espressione dei geni bersaglio, le espressioni geniche di IL-4, IL-17 e IFN-γ erano significativamente aumentate nel gruppo NPE rispetto a quelle del gruppo ME e del gruppo con operazione fittizia (Fig. 4) (P<0,05). Rispetto al gruppo con operazione fittizia, i livelli di espressione di IL-4, IL-17 e IFN-γ nel gruppo ME sono aumentati solo leggermente e non hanno raggiunto un cambiamento statistico (P > 0,05).
L'espressione dell'mRNA di IL-4, IL-17 e IFN-γ nel gruppo NPE ha mostrato un trend significativamente più elevato rispetto a quello del gruppo con operazione fittizia e del gruppo ME (P <0,05).
Al contrario, i livelli di espressione nel gruppo ME non hanno mostrato differenze significative (P>0,05).
L'analisi Western blot è stata eseguita utilizzando anticorpi disponibili in commercio contro IL-4 e IL-17 per confermare il modello di espressione dell'mRNA alterato. Come mostrato nelle Figure 5A,B, rispetto al gruppo ME e al gruppo con operazione fittizia, i livelli proteici di IL-4 e IL-17 nel gruppo NPE erano significativamente aumentati (P < 0,05). Rispetto al gruppo con operazione simulata, anche i livelli proteici di IL-4 e IL-17 nel gruppo ME non sono riusciti a raggiungere cambiamenti statisticamente significativi (P> 0,05).
(A) I livelli proteici di IL-4 e IL-17 nel gruppo NPE erano significativamente più alti di quelli del gruppo ME e del gruppo placebo (P < 0,05). (B) Istogramma Western blot.
A causa del numero limitato di campioni umani ottenuti durante l’intervento chirurgico, studi chiari e dettagliati sulla patogenesi della MC sono alquanto difficili. Abbiamo tentato di stabilire un modello animale di MC per studiarne i potenziali meccanismi patologici. Allo stesso tempo, la valutazione radiologica, la valutazione istologica e la valutazione biologica molecolare sono state utilizzate per seguire il decorso della MC indotta dall'autoinnesto NP. Di conseguenza, il modello di impianto NP ha prodotto un cambiamento graduale nell'intensità del segnale da 12 a 20 settimane (segnale basso misto nelle sequenze T1W e segnale basso nelle sequenze T2W), indicando cambiamenti tissutali e le caratteristiche istologiche e molecolari le valutazioni biologiche hanno confermato i risultati dello studio radiologico.
I risultati di questo esperimento mostrano che nel gruppo NPE si sono verificati cambiamenti visivi e istologici nel sito della violazione del corpo vertebrale. Allo stesso tempo, è stata osservata l’espressione dei geni IL-4, IL-17 e IFN-γ, nonché di IL-4, IL-17 e IFN-γ, indicando che la violazione del tessuto del nucleo polposo autologo nella colonna vertebrale corpo può causare una serie di cambiamenti di segnale e morfologici. È facile constatare che le caratteristiche del segnale dei corpi vertebrali del modello animale (segnale basso nella sequenza T1W, segnale misto e segnale basso nella sequenza T2W) sono molto simili a quelle delle cellule vertebrali umane, e anche le caratteristiche della MRI confermano le osservazioni dell'istologia e dell'anatomia generale, cioè i cambiamenti nelle cellule del corpo vertebrale sono progressivi. Sebbene la risposta infiammatoria causata da un trauma acuto possa comparire subito dopo la puntura, i risultati della MRI hanno mostrato che cambiamenti di segnale progressivamente crescenti sono comparsi 12 settimane dopo la puntura e sono persistiti fino a 20 settimane senza alcun segno di recupero o inversione dei cambiamenti della MRI. Questi risultati suggeriscono che la NP vertebrale autologa è un metodo affidabile per stabilire la VM progressiva nei conigli.
Questo modello di puntura richiede abilità, tempo e sforzo chirurgico adeguati. Negli esperimenti preliminari, la dissezione o l'eccessiva stimolazione delle strutture legamentose paravertebrali può provocare la formazione di osteofiti vertebrali. Bisogna fare attenzione a non danneggiare o irritare i dischi adiacenti. Poiché la profondità di penetrazione deve essere controllata per ottenere risultati coerenti e riproducibili, abbiamo realizzato manualmente un tappo tagliando la guaina di un ago lungo 3 mm. L'utilizzo di questo tassello garantisce una profondità di perforazione uniforme nel corpo vertebrale. Negli esperimenti preliminari, tre chirurghi ortopedici coinvolti nell'operazione hanno riscontrato che gli aghi calibro 16 sono più facili da lavorare rispetto agli aghi calibro 18 o ad altri metodi. Per evitare un eccessivo sanguinamento durante la perforazione, tenere fermo l'ago per un po' fornirà un foro di inserimento più adatto, suggerendo che un certo grado di MC può essere controllato in questo modo.
Sebbene molti studi abbiano preso di mira la MC, si sa poco sull'eziologia e sulla patogenesi della MC25,26,27. Sulla base dei nostri studi precedenti, abbiamo scoperto che l’autoimmunità gioca un ruolo chiave nella comparsa e nello sviluppo dell’MC12. Questo studio ha esaminato l’espressione quantitativa di IL-4, IL-17 e IFN-γ, che sono le principali vie di differenziazione delle cellule CD4+ dopo la stimolazione dell’antigene. Nel nostro studio, rispetto al gruppo negativo, il gruppo NPE aveva una maggiore espressione di IL-4, IL-17 e IFN-γ e anche i livelli proteici di IL-4 e IL-17 erano più alti.
Clinicamente, l'espressione dell'mRNA di IL-17 è aumentata nelle cellule NP di pazienti con ernia del disco28. Livelli di espressione aumentati di IL-4 e IFN-γ sono stati riscontrati anche in un modello di ernia del disco acuto non compressivo rispetto ai controlli sani29. IL-17 svolge un ruolo chiave nell’infiammazione, nel danno tissutale nelle malattie autoimmuni30 e migliora la risposta immunitaria all’IFN-γ31. Un aumento del danno tissutale mediato da IL-17 è stato segnalato nei topi MRL/lpr32 e nei topi sensibili all'autoimmunità33. IL-4 può inibire l'espressione di citochine proinfiammatorie (come IL-1β e TNFα) e l'attivazione dei macrofagi34. È stato riferito che l’espressione dell’mRNA di IL-4 era diversa nel gruppo NPE rispetto a IL-17 e IFN-γ nello stesso momento; L'espressione dell'mRNA dell'IFN-γ nel gruppo NPE era significativamente più alta rispetto a quella degli altri gruppi. Pertanto, la produzione di IFN-γ può essere un mediatore della risposta infiammatoria indotta dall'intercalazione di NP. Gli studi hanno dimostrato che l'IFN-γ è prodotto da più tipi di cellule, comprese le cellule T helper di tipo 1 attivate, le cellule natural killer e i macrofagi35,36, ed è una citochina proinfiammatoria chiave che promuove le risposte immunitarie37.
Questo studio suggerisce che la risposta autoimmune potrebbe essere coinvolta nella comparsa e nello sviluppo della MC. Luoma et al. hanno scoperto che le caratteristiche del segnale di MC e NP prominente sono simili alla MRI ed entrambi mostrano un segnale elevato nella sequenza T2W38. È stato confermato che alcune citochine sono strettamente associate alla comparsa di MC, come IL-139. Ma et al. ha suggerito che la sporgenza verso l'alto o verso il basso di NP possa avere una grande influenza sulla comparsa e sullo sviluppo di MC12. Bobechko40 e Herzbein et al.41 hanno riferito che NP è un tessuto immunotollerante che non può entrare nella circolazione vascolare fin dalla nascita. Le protrusioni NP introducono corpi estranei nel flusso sanguigno, mediando così reazioni autoimmuni locali42. Le reazioni autoimmuni possono indurre un gran numero di fattori immunitari e, quando questi fattori sono continuamente esposti ai tessuti, possono causare cambiamenti nella segnalazione43. In questo studio, la sovraespressione di IL-4, IL-17 e IFN-γ sono tipici fattori immunitari, dimostrando ulteriormente la stretta relazione tra NP e MC44. Questo modello animale imita bene la svolta NP e l'ingresso nella piastra terminale. Questo processo ha ulteriormente rivelato l’impatto dell’autoimmunità sulla MC.
Come previsto, questo modello animale ci fornisce una possibile piattaforma per studiare la MC. Tuttavia, questo modello presenta ancora alcune limitazioni: in primo luogo, durante la fase di osservazione degli animali, alcuni conigli allo stadio intermedio devono essere sottoposti ad eutanasia per i test istologici e di biologia molecolare, quindi alcuni animali “cadono fuori uso” nel tempo. In secondo luogo, sebbene in questo studio siano fissati tre punti temporali, sfortunatamente abbiamo modellato solo un tipo di MC (cambiamento modico di tipo I), quindi non è sufficiente per rappresentare il processo di sviluppo della malattia umana ed è necessario impostare più punti temporali osservare meglio tutti i cambiamenti del segnale. In terzo luogo, i cambiamenti nella struttura del tessuto possono effettivamente essere chiaramente evidenziati mediante colorazione istologica, ma alcune tecniche specializzate possono rivelare meglio i cambiamenti microstrutturali in questo modello. Ad esempio, la microscopia a luce polarizzata è stata utilizzata per analizzare la formazione di fibrocartilagine nei dischi intervertebrali di coniglio45. Gli effetti a lungo termine di NP su MC e placca terminale richiedono ulteriori studi.
Cinquantaquattro conigli bianchi maschi della Nuova Zelanda (peso circa 2,5-3 kg, età 3-3,5 mesi) sono stati divisi casualmente nel gruppo dell'operazione fittizia, nel gruppo di impianto muscolare (gruppo ME) e nel gruppo di impianto di radici nervose (gruppo NPE). Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato Etico dell'Ospedale di Tianjin e i metodi sperimentali sono stati eseguiti in stretta conformità con le linee guida approvate.
Sono stati apportati alcuni miglioramenti alla tecnica chirurgica di S. Sobajima46. Ciascun coniglio è stato posto in posizione di decubito laterale e la superficie anteriore di cinque dischi intervertebrali lombari consecutivi (IVD) è stata esposta utilizzando un approccio retroperitoneale posterolaterale. Ad ogni coniglio è stata somministrata un'anestesia generale (uretano al 20%, 5 ml/kg attraverso la vena dell'orecchio). È stata praticata un'incisione cutanea longitudinale dal bordo inferiore delle costole al bordo pelvico, 2 cm ventralmente ai muscoli paravertebrali. La colonna vertebrale anterolaterale destra da L1 a L6 è stata esposta mediante dissezione netta e smussa del tessuto sottocutaneo sovrastante, del tessuto retroperitoneale e dei muscoli (Fig. 6A). Il livello del disco è stato determinato utilizzando il bordo pelvico come punto di riferimento anatomico per il livello del disco L5-L6. Utilizzare un ago da puntura calibro 16 per praticare un foro vicino alla placca terminale della vertebra L5 ad una profondità di 3 mm (Fig. 6B). Utilizzare una siringa da 5 ml per aspirare il nucleo polposo autologo nel disco intervertebrale L1-L2 (Fig. 6C). Rimuovere il nucleo polposo o il muscolo secondo le esigenze di ciascun gruppo. Dopo che il foro è stato approfondito, vengono posizionate suture riassorbibili sulla fascia profonda, sulla fascia superficiale e sulla pelle, facendo attenzione a non danneggiare il tessuto periostale del corpo vertebrale durante l'intervento.
(A) Il disco L5-L6 viene esposto tramite un approccio retroperitoneale posterolaterale. (B) Utilizzare un ago calibro 16 per praticare un foro vicino alla piastra terminale L5. (C) Vengono raccolti MF autologhi.
L'anestesia generale è stata somministrata con uretano al 20% (5 ml/kg) somministrato attraverso la vena dell'orecchio e le radiografie della colonna lombare sono state ripetute a 12, 16 e 20 settimane dopo l'intervento.
I conigli sono stati sacrificati mediante iniezione intramuscolare di ketamina (25,0 mg/kg) e sodio pentobarbital per via endovenosa (1,2 g/kg) a 12, 16 e 20 settimane dopo l'intervento. L'intera colonna vertebrale è stata rimossa per l'analisi istologica ed è stata eseguita l'analisi reale. La trascrizione inversa quantitativa (RT-qPCR) e il Western blotting sono stati utilizzati per rilevare cambiamenti nei fattori immunitari.
Gli esami MRI sono stati eseguiti nei conigli utilizzando un magnete clinico da 3,0 T (GE Medical Systems, Firenze, SC) dotato di un ricevitore a bobina per arto ortogonale. I conigli sono stati anestetizzati con uretano al 20% (5 ml/kg) attraverso la vena dell'orecchio e quindi posizionati supini all'interno del magnete con la regione lombare centrata su una bobina a superficie circolare di 5 pollici di diametro (GE Medical Systems). Sono state acquisite immagini localizzatori coronali pesate in T2 (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) per definire la posizione del disco lombare da L3-L4 a L5-L6. Le fette pesate T2 del piano sagittale sono state acquisite con le seguenti impostazioni: sequenza spin-echo veloce con un tempo di ripetizione (TR) di 2200 ms e un tempo di eco (TE) di 70 ms, matrice; campo visivo di 260 e otto stimoli; Lo spessore di taglio era di 2 mm, lo spazio era di 0,2 mm.
Dopo che è stata scattata l'ultima fotografia e l'ultimo coniglio è stato ucciso, i dischi finti, incorporati nei muscoli e NP sono stati rimossi per l'esame istologico. I tessuti sono stati fissati in formalina tamponata neutra al 10% per 1 settimana, decalcificati con acido etilendiamminotetraacetico e sezionati in paraffina. I blocchi di tessuto sono stati inclusi in paraffina e tagliati in sezioni sagittali (spessore 5 μm) utilizzando un microtomo. Le sezioni sono state colorate con ematossilina ed eosina (H&E).
Dopo aver raccolto i dischi intervertebrali dai conigli di ciascun gruppo, l'RNA totale è stato estratto utilizzando una colonna UNIQ-10 (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Cina) secondo le istruzioni del produttore e un sistema di trascrizione inversa ImProm II (Promega Inc. , Madison, WI, Stati Uniti). È stata eseguita la trascrizione inversa.
RT-qPCR è stato eseguito utilizzando un Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., USA) e SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) secondo le istruzioni del produttore. Il volume della reazione PCR era di 20 μl e conteneva 1,5 μl di cDNA diluito e 0,2 μM di ciascun primer. I primer sono stati progettati da OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) e prodotti da Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Cina) (Tabella 1). Sono state utilizzate le seguenti condizioni di ciclo termico: fase iniziale di attivazione della polimerasi a 94°C per 2 minuti, quindi 40 cicli di 15 s ciascuno a 94°C per la denaturazione del modello, ricottura per 1 minuto a 60°C, estensione e fluorescenza. le misurazioni sono state eseguite per 1 minuto a 72°C. Tutti i campioni sono stati amplificati tre volte e il valore medio è stato utilizzato per l'analisi RT-qPCR. I dati di amplificazione sono stati analizzati utilizzando FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). L'espressione dei geni IL-4, IL-17 e IFN-γ è stata normalizzata rispetto al controllo endogeno (ACTB). I livelli di espressione relativi dell'mRNA target sono stati calcolati utilizzando il metodo 2-ΔΔCT.
Le proteine totali sono state estratte dai tessuti utilizzando un omogeneizzatore tissutale in tampone di lisi RIPA (contenente un cocktail di inibitori di proteasi e fosfatasi) e quindi centrifugate a 13.000 giri al minuto per 20 minuti a 4°C per rimuovere i detriti tissutali. Cinquanta microgrammi di proteine sono stati caricati per corsia, separati da SDS-PAGE al 10%, e quindi trasferiti su una membrana in PVDF. Il blocco è stato eseguito nel latte in polvere senza grassi al 5% in soluzione salina tamponata con Tris (TBS) contenente Tween 20 allo 0,1% per 1 ora a temperatura ambiente. La membrana è stata incubata con anticorpo primario anti-decorina di coniglio (diluito 1:200; Boster, Wuhan, Cina) (diluito 1:200; Bioss, Pechino, Cina) durante la notte a 4°C e ha reagito il secondo giorno; con anticorpo secondario (immunoglobulina G anti-coniglio di capra diluita 1:40.000) combinato con perossidasi di rafano (Boster, Wuhan, Cina) per 1 ora a temperatura ambiente. I segnali Western blot sono stati rilevati mediante una maggiore chemiluminescenza sulla membrana chemiluminescente dopo l'irradiazione con raggi X. Per l'analisi densitometrica, le macchie sono state scansionate e quantificate utilizzando il software BandScan e i risultati sono stati espressi come rapporto tra immunoreattività del gene bersaglio e immunoreattività della tubulina.
I calcoli statistici sono stati eseguiti utilizzando il pacchetto software SPSS16.0 (SPSS, USA). I dati raccolti durante lo studio sono stati espressi come media ± deviazione standard (media ± DS) e analizzati utilizzando l'analisi della varianza a misure ripetute unidirezionali (ANOVA) per determinare le differenze tra i due gruppi. P <0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
Pertanto, la creazione di un modello animale di MC impiantando NP autologhe nel corpo vertebrale ed eseguendo l'osservazione macroanatomica, l'analisi MRI, la valutazione istologica e l'analisi biologica molecolare può diventare uno strumento importante per valutare e comprendere i meccanismi della MC umana e sviluppare nuove terapie. interventi.
Come citare questo articolo: Han, C. et al. Un modello animale di cambiamenti Modici è stato stabilito impiantando il nucleo polposo autologo nell'osso subcondrale della colonna lombare. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J. e Boos, N. Risonanza magnetica della colonna lombare: prevalenza di ernia e ritenzione del disco, compressione delle radici nervose, anomalie della placca terminale e osteoartrite delle faccette articolari in volontari asintomatici . valutare. Radiologia 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS e Leboeuf-Eed, K. Modic cambiano e la loro relazione con i risultati clinici. European Spine Journal: pubblicazione ufficiale della European Spine Society, della European Society of Spinal Deformity e della European Society for Cervical Spine Research 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M., et al. Cambiamenti modici nelle placche vertebrali lombari: prevalenza e associazione con lombalgia e sciatica nei lavoratori maschi di mezza età. Dorso 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K. e Dalinka, M. MRI dei cambiamenti del midollo osseo vicino alla placca terminale nella malattia degenerativa della colonna lombare. AJR. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ e Carter, JR Malattia degenerativa del disco: valutazione dei cambiamenti del midollo vertebrale con la risonanza magnetica. Radiologia 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS e Carter, JR Imaging della malattia degenerativa del disco. Radiologia 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS, et al. I predittori dei cambiamenti del segnale della placca terminale neovertebrale (Modic) nella popolazione generale. European Spine Journal: Pubblicazione ufficiale della European Spine Society, della European Society of Spinal Deformity e della European Society for Cervical Spine Research, Divisione 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB e Mannisch, K. Modic cambia dopo l'ernia del disco lombare. European Spine Journal: pubblicazione ufficiale della European Spine Society, della European Society of Spinal Deformity e della European Society for Cervical Spine Research 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M. e Kaapa, E. I cambiamenti modici di tipo I possono prevedere una degenerazione deformativa del disco rapidamente progressiva: uno studio prospettico di 1 anno. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ e Fan, SW Cambiamenti modici: possibili cause e contributo alla degenerazione del disco lombare. Ipotesi mediche 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Rottura del disco interno. Problemi di prolasso del disco da oltre 50 anni. Spina dorsale (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
Orario di pubblicazione: 13 dicembre 2024