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L'istituzione di modelli animali di cambiamento modificato (MC) è una base importante per lo studio di MC. Cinquantaquattro conigli bianchi della Nuova Zelanda sono stati divisi in gruppo di operazione sham, gruppo di impianto muscolare (gruppo ME) e gruppo di impianto del nucleo polposo (gruppo NPE). Nel gruppo NPE, il disco intervertebrale è stato esposto dall'approccio chirurgico lombare anterolaterale e un ago è stato usato per perforare il corpo vertebrale L5 vicino alla piastra finale. NP è stato estratto dal disco intervertebrale L1/2 da una siringa e iniettato in esso. Perforando un buco nell'osso subcondrale. Le procedure chirurgiche e i metodi di perforazione nel gruppo di impianto muscolare e nel gruppo di operazione sham erano le stesse di quelle del gruppo di impianto NP. Nel gruppo ME, un pezzo di muscolo è stato inserito nel buco, mentre nel gruppo di operazione sham, nulla è stato posto nel buco. Dopo l'operazione, sono stati eseguiti la scansione della risonanza magnetica e i test biologici molecolari. Il segnale nel gruppo NPE è cambiato, ma non vi è stato un evidente cambiamento di segnale nel gruppo di operazione sham e nel gruppo ME. L'osservazione istologica ha mostrato che nel gruppo dell'impianto è stata osservata proliferazione del tessuto anormale e l'espressione di IL-4, IL-17 e IFN-γ è stata aumentata nel gruppo NPE. L'impianto di NP nell'osso subcondrale può formare un modello animale di MC.
Cambiamenti modificanti (MC) sono lesioni delle piastre finali vertebrali e del midollo osseo adiacenti visibili sulla risonanza magnetica (MRI). Sono abbastanza comuni negli individui con sintomi associati1. Molti studi hanno sottolineato l'importanza di MC a causa della sua associazione con lombalgia (LBP) 2,3. De Roos et al.4 e Modic et al.5 hanno descritto in modo indipendente tre diversi tipi di anomalie del segnale subcondrale nel midollo osseo vertebrale. I cambiamenti di tipo I MODIC sono ipointensi sulle sequenze ponderate T1 (T1W) e iperintense nelle sequenze ponderate T2 (T2W). Questa lesione rivela piastre di terminazioni di fissure e tessuto di granulazione vascolare adiacente nel midollo osseo. Le modifiche MODIC di tipo II mostrano un segnale elevato su entrambe le sequenze T1W e T2W. In questo tipo di lesione, si può trovare la distruzione della piastra terminale, nonché la sostituzione del grasso istologico del midollo osseo adiacente. Le modifiche MODIC di tipo III mostrano un segnale basso nelle sequenze T1W e T2W. Sono state osservate lesioni sclerotiche corrispondenti alle piastre finali6. MC è considerato una malattia patologica della colonna vertebrale ed è strettamente associata a molte malattie degenerative della colonna vertebrale7,8,9.
Considerando i dati disponibili, diversi studi hanno fornito approfondimenti dettagliati sull'eziologia e sui meccanismi patologici di MC. Albert et al. ha suggerito che MC potrebbe essere causato da Disc Hernia8. Hu et al. attribuito MC alla grave degenerazione del disco10. Kroc ha proposto il concetto di "rottura del disco interno", che afferma che il trauma del disco ripetitivo può portare a microteari nella piastra terminale. Dopo la formazione delle fessure, la distruzione della piastra terminale da parte del nucleo polposo (NP) può innescare una risposta autoimmune, che porta ulteriormente allo sviluppo di MC11. Ma et al. Ha condiviso una visione simile e ha riferito che l'autoimmunità indotta da NP svolge un ruolo chiave nella patogenesi di MC12.
Le cellule del sistema immunitario, in particolare i linfociti di helper CD4+ T, svolgono un ruolo critico nella patogenesi dell'autoimmunità13. Il sottoinsieme Th17 recentemente scoperto produce la citochina proinfiammatoria IL-17, promuove l'espressione della chemochina e stimola le cellule T negli organi danneggiati per produrre IFN-γ14. Le cellule Th2 svolgono anche un ruolo unico nella patogenesi delle risposte immunitarie. L'espressione di IL-4 come cellula Th2 rappresentativa può portare a gravi conseguenze immunopatologiche15.
Sebbene molti studi clinici siano stati condotti su MC16,17,18,19,20,21,22,23,24, c'è ancora una mancanza di modelli sperimentali animali adatti che possono imitare il processo MC che si verifica frequentemente nell'uomo e può essere Utilizzato per studiare l'eziologia o nuovi trattamenti come la terapia mirata. Ad oggi, sono stati segnalati solo alcuni modelli animali di MC per studiare i meccanismi patologici sottostanti.
Sulla base della teoria autoimmune proposta da Albert e MA, questo studio ha stabilito un modello MC di coniglio semplice e riproducibile mediante NP autotrapianto vicino alla piastra finale vertebrale perforata. Altri obiettivi sono osservare le caratteristiche istologiche dei modelli animali e valutare i meccanismi specifici di NP nello sviluppo di MC. A tal fine, utilizziamo tecniche come la biologia molecolare, la risonanza magnetica e gli studi istologici per studiare la progressione di MC.
Due conigli sono morti di sanguinamento durante l'intervento chirurgico e quattro conigli sono morti durante l'anestesia durante la risonanza magnetica. I restanti 48 conigli sono sopravvissuti e non hanno mostrato segni comportamentali o neurologici dopo l'intervento chirurgico.
La risonanza magnetica mostra che l'intensità del segnale del tessuto incorporato in diversi fori è diversa. L'intensità del segnale del corpo vertebrale L5 nel gruppo NPE è cambiata gradualmente a 12, 16 e 20 settimane dopo l'inserimento (la sequenza T1W ha mostrato un segnale basso e la sequenza T2W ha mostrato un segnale misto più segnale basso) (Fig. 1C), mentre le apparenze MRI degli altri due gruppi di parti incorporate sono rimasti relativamente stabili durante lo stesso periodo (Fig. 1A, b).
(A) MRIS sequenziale rappresentativa della colonna lombare di coniglio in 3 punti temporali. Non sono state trovate anomalie del segnale nelle immagini del gruppo di operazione sham. (B) Le caratteristiche del segnale del corpo vertebrale nel gruppo ME sono simili a quelle del gruppo di operazione sham e non si osserva un cambiamento significativo del segnale nel sito di incorporamento nel tempo. (C) Nel gruppo NPE, il segnale basso è chiaramente visibile nella sequenza T1W e il segnale misto e il segnale basso sono chiaramente visibili nella sequenza T2W. Dal periodo di 12 settimane al periodo di 20 settimane, gli sporadici segnali elevati che circondano i segnali bassi nella sequenza T2W diminuiscono.
L'iperplasia ossea evidente può essere vista nel sito di impianto del corpo vertebrale nel gruppo NPE e l'iperplasia ossea si verifica più veloce corpi; Gruppo Sham Group e ME (Fig. 2C) 2A, b).
(A) La superficie del corpo vertebrale nella porzione impiantata è molto liscia, il foro guarisce bene e non c'è iperplasia nel corpo vertebrale. (B) La forma del sito impiantato nel gruppo ME è simile a quella nel gruppo operativo sham e non vi è alcun cambiamento evidente nell'aspetto del sito impiantato nel tempo. (C) L'iperplasia ossea si è verificata nel sito impiantato nel gruppo NPE. L'iperplasia ossea aumentava rapidamente e persino si estende attraverso il disco intervertebrale al corpo vertebrale controlaterale.
L'analisi istologica fornisce informazioni più dettagliate sulla formazione ossea. La Figura 3 mostra le fotografie delle sezioni postoperatorie colorate con H&E. Nel gruppo di operazione sham, i condrociti erano ben disposti e non è stata rilevata alcuna proliferazione cellulare (Fig. 3A). La situazione nel gruppo ME era simile a quella nel gruppo di operazione sham (Fig. 3B). Tuttavia, nel gruppo NPE, nel sito di impianto sono stati osservati un gran numero di condrociti e proliferazione di cellule simili a NP (Fig. 3C);
(A) Le trabecole possono essere viste vicino alla piastra finale, i condrociti sono disposti ordinatamente con dimensioni e forma delle cellule uniformi e nessuna proliferazione (40 volte). (B) La condizione del sito di impianto nel gruppo ME è simile a quella del gruppo sham. Si possono vedere trabecole e condrociti, ma non esiste una proliferazione evidente nel sito di impianto (40 volte). (B) Si può vedere che i condrociti e le cellule simili a NP proliferano significativamente e la forma e le dimensioni dei condrociti sono irregolari (40 volte).
L'espressione di mRNA di interleuchina 4 (IL-4), mRNA di interleuchina 17 (IL-17) e mRNA di interferone γ (IFN-γ) sono stati osservati nei gruppi NPE e ME. Quando sono stati confrontati i livelli di espressione dei geni target, le espressioni geniche di IL-4, IL-17 e IFN-γ sono state significativamente aumentate nel gruppo NPE rispetto a quelle del gruppo ME e del gruppo operativo sham (Fig. 4) (P <0,05). Rispetto al gruppo operativo sham, i livelli di espressione di IL-4, IL-17 e IFN-γ nel gruppo ME sono aumentati solo leggermente e non hanno raggiunto il cambiamento statistico (p> 0,05).
L'espressione di mRNA di IL-4, IL-17 e IFN-γ nel gruppo NPE ha mostrato una tendenza significativamente più alta rispetto a quella del gruppo operativo sham e del gruppo ME (P <0,05).
Al contrario, i livelli di espressione nel gruppo ME non hanno mostrato differenze significative (p> 0,05).
L'analisi Western blot è stata eseguita utilizzando anticorpi disponibili in commercio contro IL-4 e IL-17 per confermare il modello di espressione dell'mRNA alterato. Come mostrato nelle figure 5a, b, rispetto al gruppo ME e al gruppo operativo sham, i livelli di proteina di IL-4 e IL-17 nel gruppo NPE sono stati significativamente aumentati (p <0,05). Rispetto al gruppo operativo sham, anche i livelli di proteina di IL-4 e IL-17 nel gruppo ME non sono riusciti a raggiungere cambiamenti statisticamente significativi (P> 0,05).
(A) I livelli proteici di IL-4 e IL-17 nel gruppo NPE erano significativamente più alti di quelli del gruppo ME e del gruppo placebo (P <0,05). (B) istogramma Western blot.
A causa del numero limitato di campioni umani ottenuti durante l'intervento chirurgico, studi chiari e dettagliati sulla patogenesi di MC sono in qualche modo difficili. Abbiamo tentato di stabilire un modello animale di MC per studiare i suoi potenziali meccanismi patologici. Allo stesso tempo, la valutazione radiologica, la valutazione istologica e la valutazione biologica molecolare sono state utilizzate per seguire il corso di MC indotto dall'autotrapianto NP. Di conseguenza, il modello di impianto NP ha comportato una graduale variazione dell'intensità del segnale da punti temporali da 12 a 20 settimane (segnale misto basso nelle sequenze T1W e un segnale basso nelle sequenze T2W), indicando cambiamenti di tessuto e istologica e molecolare Le valutazioni biologiche hanno confermato i risultati dello studio radiologico.
I risultati di questo esperimento mostrano che i cambiamenti visivi e istologici si sono verificati nel sito della violazione del corpo vertebrale nel gruppo NPE. Allo stesso tempo, sono state osservate l'espressione dei geni IL-4, IL-17 e IFN-γ, nonché IL-4, IL-17 e IFN-γ, indicando che la violazione del tessuto del nucleo del nucleo autologo nel vertebrale Il corpo può causare una serie di segnale e cambiamenti morfologici. È facile scoprire che le caratteristiche del segnale dei corpi vertebrali del modello animale (segnale basso nella sequenza T1W, il segnale misto e il segnale basso nella sequenza T2W) sono molto simili a quelle delle cellule vertebrali umane e anche le caratteristiche della risonanza magnetica Conferma le osservazioni dell'istologia e dell'anatomia grossolana, cioè i cambiamenti nelle cellule del corpo vertebrale sono progressivi. Sebbene la risposta infiammatoria causata da un trauma acuto possa apparire subito dopo la puntura, i risultati della risonanza magnetica hanno mostrato che le variazioni progressivamente aumentate del segnale sono apparse 12 settimane dopo la puntura e persistevano fino a 20 settimane senza alcun segno di recupero o inversione delle variazioni di risonanza magnetica. Questi risultati suggeriscono che NP vertebrale autologo è un metodo affidabile per stabilire MV progressivo nei conigli.
Questo modello di puntura richiede un'adeguata abilità, tempo e sforzo chirurgico. Negli esperimenti preliminari, la dissezione o l'eccessiva stimolazione delle strutture legamentose paravertebrali possono comportare la formazione di osteofiti vertebrali. Si dovrebbe fare attenzione a non danneggiare o irritare i dischi adiacenti. Poiché la profondità di penetrazione deve essere controllata per ottenere risultati coerenti e riproducibili, abbiamo realizzato manualmente una spina tagliando la guaina di un ago lungo 3 mm. L'uso di questa spina garantisce una profondità di perforazione uniforme nel corpo vertebrale. Negli esperimenti preliminari, tre chirurghi ortopedici coinvolti nell'operazione hanno riscontrato che gli aghi di calibro a 16 calibri sono più facili da lavorare con aghi di calibro 18 o altri metodi. Per evitare l'eccessivo sanguinamento durante la perforazione, tenere fermo l'ago per un po 'fornirà un foro di inserimento più adatto, suggerendo che un certo grado di MC può essere controllato in questo modo.
Sebbene molti studi abbiano preso di mira MC, si sa poco sull'eziologia e sulla patogenesi di MC25,26,27. Sulla base dei nostri studi precedenti, abbiamo scoperto che l'autoimmunità svolge un ruolo chiave nel verificarsi e nello sviluppo di MC12. Questo studio ha esaminato l'espressione quantitativa di IL-4, IL-17 e IFN-γ, che sono le principali vie di differenziazione delle cellule CD4+ dopo la stimolazione dell'antigene. Nel nostro studio, rispetto al gruppo negativo, il gruppo NPE aveva una maggiore espressione di IL-4, IL-17 e IFN-γ e anche i livelli proteici di IL-4 e IL-17 erano più elevati.
Clinicamente, l'espressione dell'mRNA di IL-17 è aumentata nelle cellule NP da pazienti con ernia del disco28. I livelli di espressione di IL-4 e IFN-γ sono stati anche trovati in un modello acuto di ernia del disco non compressivo rispetto ai controlli sani29. L'IL-17 svolge un ruolo chiave nell'infiammazione, lesioni ai tessuti nelle malattie autoimmuni30 e migliora la risposta immunitaria all'IFN-γ31. La lesione del tessuto mediata da IL-17 migliorata è stata riportata nei topi MRL/LPR32 e nei topi33 sensibili all'autoimmunità. L'IL-4 può inibire l'espressione delle citochine proinfiammatorie (come IL-1β e TNFα) e l'attivazione dei macrofagi34. È stato riferito che l'espressione dell'mRNA di IL-4 era diversa nel gruppo NPE rispetto a IL-17 e IFN-γ nello stesso punto temporale; L'espressione dell'mRNA di IFN-γ nel gruppo NPE era significativamente più alta di quella degli altri gruppi. Pertanto, la produzione di IFN-γ può essere un mediatore della risposta infiammatoria indotta dall'intercalazione di NP. Gli studi hanno dimostrato che l'IFN-γ è prodotto da più tipi di cellule, tra cui cellule T di helper di tipo 1 attivate, cellule killer naturali e macrofagi35,36, ed è una citochina pro-infiammatoria chiave che promuove le risposte immunitarie37.
Questo studio suggerisce che la risposta autoimmune può essere coinvolta nel verificarsi e nello sviluppo di MC. Luoma et al. ha scoperto che le caratteristiche del segnale di MC e NP di spicco sono simili sulla risonanza magnetica ed entrambe mostrano un segnale elevato nella sequenza T2W38. Alcune citochine sono state confermate strettamente associate al verificarsi di MC, come IL-139. Ma et al. ha suggerito che la sporgenza verso l'alto o verso il basso di NP può avere una grande influenza sul verificarsi e lo sviluppo di MC12. Bobechko40 e Herzbein et al.41 hanno riferito che NP è un tessuto immunotollerante che non può entrare nella circolazione vascolare dalla nascita. Le sporgenze NP introducono corpi estranei nell'afflusso di sangue, mediando così le reazioni autoimmuni locali42. Le reazioni autoimmuni possono indurre un gran numero di fattori immunitari e quando questi fattori sono continuamente esposti ai tessuti, possono causare cambiamenti nella segnalazione43. In questo studio, la sovraespressione di IL-4, IL-17 e IFN-γ sono tipici fattori immunitari, dimostrando ulteriormente la stretta relazione tra NP e MCS44. Questo modello animale imita bene la svolta NP e l'ingresso nella piastra finale. Questo processo ha inoltre rivelato l'impatto dell'autoimmunità su MC.
Come previsto, questo modello animale ci fornisce una possibile piattaforma per studiare MC. Tuttavia, questo modello ha ancora alcune limitazioni: in primo luogo, durante la fase di osservazione degli animali, alcuni conigli in stadio intermedio devono essere eutanizzati per i test di biologia istologica e molecolare, quindi alcuni animali "cadono fuori uso" nel tempo. In secondo luogo, sebbene in questo studio siano fissati tre punti temporali, sfortunatamente, abbiamo modellato solo un tipo di MC (modifica di tipo I MODIC), quindi non è sufficiente rappresentare il processo di sviluppo delle malattie umane e devono essere imposti più punti temporali Osservare meglio tutti i cambiamenti del segnale. In terzo luogo, i cambiamenti nella struttura dei tessuti possono effettivamente essere chiaramente mostrati dalla colorazione istologica, ma alcune tecniche specializzate possono rivelare meglio i cambiamenti microstrutturali in questo modello. Ad esempio, la microscopia ottica polarizzata è stata utilizzata per analizzare la formazione di fibrocartilagine nei dischi intervertebrali di coniglio45. Gli effetti a lungo termine di NP su MC e EndPlate richiedono ulteriori studi.
Cinquantaquattro conigli bianchi della Nuova Zelanda (peso di circa 2,5-3 kg, età 3-3,5 mesi) sono stati divisi in modo casuale in gruppo operativo sham, gruppo di impianti muscolari (gruppo ME) e gruppo di impiantamento della radice nervosa (gruppo NPE). Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato etico dell'ospedale di Tianjin e i metodi sperimentali sono stati eseguiti in stretto conformità con le linee guida approvate.
Sono stati apportati alcuni miglioramenti alla tecnica chirurgica di S. sobajima 46. Ogni coniglio è stato collocato in una posizione di recumbence laterale e la superficie anteriore di cinque dischi intervertebrali lombari consecutivi (IVD) è stata esposta utilizzando un approccio retroperitoneale posterolaterale. A ogni coniglio è stata somministrata anestesia generale (uretano al 20%, 5 ml/kg attraverso la vena dell'orecchio). Un'incisione cutanea longitudinale è stata fatta dal bordo inferiore delle costole fino al bordo pelvico, ventrale di 2 cm ai muscoli paravertebrali. La colonna anterolaterale destra da L1 a L6 è stata esposta mediante dissezione acuta e contundente del tessuto sottocutaneo sovrastante, del tessuto retroperitoneale e dei muscoli (Fig. 6A). Il livello del disco è stato determinato usando l'orlo pelvico come un punto di riferimento anatomico per il livello del disco L5-L6. Utilizzare un ago di puntura a 16 calibri per perforare un foro vicino alla piastra finale della vertebra L5 a una profondità di 3 mm (Fig. 6B). Utilizzare una siringa da 5 ml per aspirare il nucleo polposus autologo nel disco intervertebrale L1-L2 (Fig. 6C). Rimuovere il nucleo polposo o il muscolo in base ai requisiti di ciascun gruppo. Dopo aver approfondito il foro, le suture assorbibili vengono posizionate sulla fascia profonda, la fascia superficiale e la pelle, facendo attenzione a non danneggiare il tessuto periostale del corpo vertebrale durante l'intervento chirurgico.
(A) Il disco L5 - L6 è esposto tramite un approccio retroperitoneale posterolaterale. (B) Utilizzare un ago per calibri da 16 per praticare un foro vicino alla piastra terminale L5. (C) Vengono raccolti MF autologhi.
L'anestesia generale è stata somministrata con uretano al 20% (5 ml/kg) somministrato attraverso la vena dell'orecchio e le radiografie della colonna lombare sono state ripetute a 12, 16 e 20 settimane dopo l'intervento.
I conigli sono stati sacrificati mediante iniezione intramuscolare di ketamina (25,0 mg/kg) e pentobarbital per via endovenosa di sodio (1,2 g/kg) a 12, 16 e 20 settimane dopo l'intervento chirurgico. L'intera colonna vertebrale è stata rimossa per l'analisi istologica ed è stata eseguita un'analisi reale. La trascrizione inversa quantitativa (RT-QPCR) e Western blotting sono state utilizzate per rilevare i cambiamenti nei fattori immunitari.
Gli esami di risonanza magnetica sono stati eseguiti in conigli utilizzando un magnete clinico 3,0 T (GE Medical Systems, Firenze, SC) dotato di un ricevitore a bobina di arti ortogonali. I conigli sono stati anestetizzati con uretano al 20% (5 ml/kg) attraverso la vena dell'orecchio e quindi posizionati supini all'interno del magnete con la regione lombare centrata su una bobina di superficie circolare di diametro da 5 pollici (GE Medical Systems). Sono state acquisite immagini di localizzatore coronale T2 (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) per definire la posizione del disco lombare da L3-L4 a L5-L6. Sono state acquisite fette ponderate del piano sagittale T2 con le seguenti impostazioni: sequenza di spin-eco rapida con un tempo di ripetizione (TR) di 2200 ms e un tempo di eco (TE) di 70 ms, matrice; campo visivo di 260 e otto stimoli; Lo spessore del taglio era di 2 mm, il divario era di 0,2 mm.
Dopo aver scattato l'ultima fotografia e l'ultimo coniglio è stato ucciso, i dischi fusi, incorporati muscolari e NP sono stati rimossi per l'esame istologico. I tessuti sono stati fissati in formalina tamponata neutra al 10% per 1 settimana, decalcificata con acido etilendiaminetetraacetico e paraffina sezionata. I blocchi di tessuto sono stati incorporati in paraffina e tagliati in sezioni sagittali (5 μm di spessore) usando un microtomo. Le sezioni sono state colorate con ematossilina ed eosina (H&E).
Dopo aver raccolto i dischi intervertebrali dai conigli in ciascun gruppo, l'RNA totale è stato estratto utilizzando una colonna uniq-10 (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Cina) secondo le istruzioni del produttore e un sistema di trascrizione inverso II II (Promega Inc. , Madison, WI, USA). È stata eseguita la trascrizione inversa.
RT-QPCR è stato eseguito utilizzando un PRISM 7300 (Applied Biosystems Inc., USA) e Sybr Green Jump Start Taq Readymix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) secondo le istruzioni del produttore. Il volume di reazione PCR era di 20 μL e conteneva 1,5 μL di cDNA diluito e 0,2 μM di ciascun primer. I primer sono stati progettati da Oligoperfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) e fabbricati da Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Cina) (Tabella 1). Sono state utilizzate le seguenti condizioni di ciclismo termico: fase iniziale di attivazione della polimerasi a 94 ° C per 2 minuti, quindi 40 cicli di 15 s ciascuno a 94 ° C per denaturazione del modello, ricottura per 1 minuto a 60 ° C, estensione e fluorescenza. Le misurazioni sono state eseguite per 1 minuto a 72 ° C. Tutti i campioni sono stati amplificati tre volte e il valore medio è stato utilizzato per l'analisi RT-QPCR. I dati di amplificazione sono stati analizzati utilizzando FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). L'espressione del gene IL-4, IL-17 e IFN-γ è stata normalizzata al controllo endogeno (ACTB). I livelli di espressione relativa dell'mRNA target sono stati calcolati usando il metodo 2-ΔΔCT.
La proteina totale è stata estratta dai tessuti usando un omogeneizzatore di tessuto nel tampone di lisi RIPA (contenente un cocktail di proteasi e inibitori della fosfatasi) e quindi centrifugata a 13.000 rpm per 20 minuti a 4 ° C per rimuovere i detriti dei tessuti. Cinquanta microgrammi di proteina sono stati caricati per corsia, separati dal 10% di SDS-PAGE e quindi trasferiti su una membrana PVDF. Il blocco è stato eseguito in latte secco non grasso al 5% in soluzione salina tamponata con Tris (TBS) contenente 0,1% di Tween 20 per 1 ora a temperatura ambiente. La membrana è stata incubata con anticorpo primario anti-decorina di coniglio (diluito 1: 200; Boster, Wuhan, Cina) (diluito 1: 200; Bioss, Pechino, Cina) durante la notte a 4 ° C e ha reagito il secondo giorno; Con anticorpo secondario (immunoglobulina G di capra a 1: 40.000 diluizione) combinata con perossidasi di rafano (Boster, Wuhan, Cina) per 1 ora a temperatura ambiente. I segnali Western blot sono stati rilevati mediante aumento della chemiluminescenza sulla membrana chemiluminescente dopo irradiazione a raggi X. Per l'analisi densitometrica, le macchie sono state scansionate e quantificate utilizzando il software BandSCan e i risultati sono stati espressi come rapporto tra immunoreattività genica bersaglio e immunoreattività della tubulina.
I calcoli statistici sono stati eseguiti utilizzando il pacchetto software SPSS16.0 (SPSS, USA). I dati raccolti durante lo studio sono stati espressi come deviazione media ± standard (media ± DS) e analizzati utilizzando l'analisi delle misure ripetute di una via della varianza (ANOVA) per determinare le differenze tra i due gruppi. P <0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
Pertanto, l'istituzione di un modello animale di MC impiantando le NP autologhe nel corpo vertebrale e eseguendo l'osservazione macroanatomica, l'analisi della risonanza magnetica, la valutazione istologica e l'analisi biologica molecolare possono diventare uno strumento importante per valutare e comprendere i meccanismi di MC umana e lo sviluppo di nuovi terapeutici terapeutici interventi.
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Post Time: dicembre-13-2024