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La creazione di modelli animali di modificazione motoria (CM) è una base importante per lo studio della CM. Cinquantaquattro conigli bianchi della Nuova Zelanda sono stati divisi in tre gruppi: gruppo di intervento simulato, gruppo di impianto muscolare (gruppo ME) e gruppo di impianto di nucleo polposo (gruppo NPE). Nel gruppo NPE, il disco intervertebrale è stato esposto mediante un approccio chirurgico lombare anterolaterale e un ago è stato utilizzato per perforare il corpo vertebrale L5 vicino alla placca terminale. Il nucleo polposo è stato estratto dal disco intervertebrale L1/2 con una siringa e iniettato al suo interno. È stato praticato un foro nell'osso subcondrale. Le procedure chirurgiche e i metodi di perforazione nel gruppo di impianto muscolare e nel gruppo di intervento simulato erano gli stessi del gruppo di impianto di nucleo polposo. Nel gruppo ME, un frammento di muscolo è stato posizionato nel foro, mentre nel gruppo di intervento simulato non è stato inserito nulla. Dopo l'intervento, sono state eseguite una risonanza magnetica e analisi di biologia molecolare. Il segnale nel gruppo NPE è cambiato, ma non si sono osservati cambiamenti evidenti del segnale nel gruppo sottoposto a intervento simulato e nel gruppo ME. L'osservazione istologica ha mostrato una proliferazione tissutale anomala nel sito di impianto e un aumento dell'espressione di IL-4, IL-17 e IFN-γ nel gruppo NPE. L'impianto di NP nell'osso subcondrale può costituire un modello animale di MC.
Le alterazioni di Modic (MC) sono lesioni delle placche terminali vertebrali e del midollo osseo adiacente, visibili alla risonanza magnetica (RM). Sono piuttosto comuni negli individui con sintomi associati1. Molti studi hanno sottolineato l'importanza delle MC a causa della loro associazione con il dolore lombare (LBP)2,3. De Roos et al.4 e Modic et al.5 hanno descritto per primi, indipendentemente l'uno dall'altro, tre diversi tipi di anomalie del segnale subcondrale nel midollo osseo vertebrale. Le alterazioni di Modic di tipo I sono ipointense nelle sequenze T1-pesate (T1W) e iperintense nelle sequenze T2-pesate (T2W). Questa lesione rivela le placche terminali delle fessure e il tessuto di granulazione vascolare adiacente nel midollo osseo. Le alterazioni di Modic di tipo II mostrano un segnale elevato sia nelle sequenze T1W che T2W. In questo tipo di lesione, si può riscontrare la distruzione della placca terminale, così come la sostituzione adiposa istologica del midollo osseo adiacente. Le alterazioni di Modic di tipo III mostrano un segnale basso nelle sequenze T1W e T2W. Sono state osservate lesioni sclerotiche corrispondenti alle placche terminali6. La MC è considerata una malattia patologica della colonna vertebrale ed è strettamente associata a molte malattie degenerative della colonna vertebrale7,8,9.
Considerando i dati disponibili, diversi studi hanno fornito approfondimenti dettagliati sull'eziologia e sui meccanismi patologici della MC. Albert et al. hanno suggerito che la MC possa essere causata da un'ernia del disco8. Hu et al. hanno attribuito la MC a una grave degenerazione del disco10. Kroc ha proposto il concetto di "rottura interna del disco", secondo il quale un trauma ripetuto al disco può portare a microlesioni nella placca terminale. Dopo la formazione della fessura, la distruzione della placca terminale da parte del nucleo polposo (NP) può innescare una risposta autoimmune, che a sua volta porta allo sviluppo della MC11. Ma et al. hanno condiviso un punto di vista simile e hanno riportato che l'autoimmunità indotta dal NP gioca un ruolo chiave nella patogenesi della MC12.
Le cellule del sistema immunitario, in particolare i linfociti T helper CD4+, svolgono un ruolo cruciale nella patogenesi dell'autoimmunità13. Il sottogruppo Th17, scoperto di recente, produce la citochina proinfiammatoria IL-17, promuove l'espressione delle chemochine e stimola i linfociti T negli organi danneggiati a produrre IFN-γ14. Anche le cellule Th2 svolgono un ruolo unico nella patogenesi delle risposte immunitarie. L'espressione di IL-4, tipica delle cellule Th2, può portare a gravi conseguenze immunopatologiche15.
Sebbene siano stati condotti numerosi studi clinici sulla MC16,17,18,19,20,21,22,23,24, mancano ancora modelli sperimentali animali adeguati in grado di riprodurre il processo di MC che si verifica frequentemente negli esseri umani e che possono essere utilizzati per studiare l'eziologia o nuovi trattamenti come la terapia mirata. Ad oggi, sono stati riportati solo pochi modelli animali di MC per studiare i meccanismi patologici sottostanti.
Basandosi sulla teoria autoimmune proposta da Albert e Ma, questo studio ha creato un modello di MC (condromatosi cervicale) semplice e riproducibile nel coniglio mediante autotrapianto di NP (nucleoprotesico) in prossimità della placca terminale vertebrale perforata. Altri obiettivi sono osservare le caratteristiche istologiche dei modelli animali e valutare i meccanismi specifici dell'NP nello sviluppo della MC. A tal fine, utilizziamo tecniche come la biologia molecolare, la risonanza magnetica e studi istologici per studiare la progressione della MC.
Due conigli sono morti per emorragia durante l'intervento chirurgico e quattro sono morti durante l'anestesia per la risonanza magnetica. I restanti 48 conigli sono sopravvissuti e non hanno mostrato segni comportamentali o neurologici dopo l'intervento.
La risonanza magnetica mostra che l'intensità del segnale del tessuto incorporato nei diversi fori è differente. L'intensità del segnale del corpo vertebrale L5 nel gruppo NPE è cambiata gradualmente a 12, 16 e 20 settimane dall'inserimento (la sequenza T1W ha mostrato un segnale basso e la sequenza T2W ha mostrato un segnale misto più un segnale basso) (Fig. 1C), mentre l'aspetto alla risonanza magnetica degli altri due gruppi di parti incorporate è rimasto relativamente stabile durante lo stesso periodo (Fig. 1A, B).
(A) Immagini RM sequenziali rappresentative della colonna lombare del coniglio in 3 momenti diversi. Non sono state riscontrate anomalie di segnale nelle immagini del gruppo sottoposto a intervento simulato. (B) Le caratteristiche del segnale del corpo vertebrale nel gruppo ME sono simili a quelle del gruppo sottoposto a intervento simulato e non si osserva alcuna variazione significativa del segnale nel sito di inclusione nel tempo. (C) Nel gruppo NPE, il segnale basso è chiaramente visibile nella sequenza T1W e il segnale misto e il segnale basso sono chiaramente visibili nella sequenza T2W. Dal periodo di 12 settimane al periodo di 20 settimane, i segnali alti sporadici che circondano i segnali bassi nella sequenza T2W diminuiscono.
Nel gruppo NPE si può osservare un'evidente iperplasia ossea nel sito di impianto del corpo vertebrale, e l'iperplasia ossea si verifica più rapidamente da 12 a 20 settimane (Fig. 2C) rispetto al gruppo NPE, non si osserva alcun cambiamento significativo nei corpi vertebrali modellati; gruppo Sham e gruppo ME (Fig. 2C) 2A,B).
(A) La superficie del corpo vertebrale nella porzione impiantata è molto liscia, il foro guarisce bene e non vi è iperplasia nel corpo vertebrale. (B) La forma del sito di impianto nel gruppo ME è simile a quella del gruppo sottoposto a intervento simulato e non vi è alcun cambiamento evidente nell'aspetto del sito di impianto nel tempo. (C) Nel gruppo NPE si è verificata iperplasia ossea nel sito di impianto. L'iperplasia ossea è aumentata rapidamente e si è persino estesa attraverso il disco intervertebrale al corpo vertebrale controlaterale.
L'analisi istologica fornisce informazioni più dettagliate sulla formazione ossea. La Figura 3 mostra le fotografie delle sezioni postoperatorie colorate con H&E. Nel gruppo sottoposto a intervento simulato, i condrociti erano ben disposti e non è stata rilevata alcuna proliferazione cellulare (Fig. 3A). La situazione nel gruppo ME era simile a quella del gruppo sottoposto a intervento simulato (Fig. 3B). Tuttavia, nel gruppo NPE, è stato osservato un gran numero di condrociti e la proliferazione di cellule simili a NP nel sito di impianto (Fig. 3C);
(A) Le trabecole sono visibili vicino alla placca terminale, i condrociti sono disposti ordinatamente con dimensioni e forma cellulari uniformi e nessuna proliferazione (40 ingrandimenti). (B) La condizione del sito di impianto nel gruppo ME è simile a quella del gruppo sham. Sono visibili trabecole e condrociti, ma non vi è alcuna proliferazione evidente nel sito di impianto (40 ingrandimenti). (B) Si può osservare che i condrociti e le cellule simili al nucleo polposo proliferano in modo significativo e la forma e le dimensioni dei condrociti sono irregolari (40 ingrandimenti).
L'espressione dell'mRNA dell'interleuchina 4 (IL-4), dell'interleuchina 17 (IL-17) e dell'interferone γ (IFN-γ) è stata osservata sia nel gruppo NPE che nel gruppo ME. Confrontando i livelli di espressione dei geni target, l'espressione genica di IL-4, IL-17 e IFN-γ è risultata significativamente aumentata nel gruppo NPE rispetto al gruppo ME e al gruppo sottoposto a intervento simulato (Fig. 4) (P < 0,05). Rispetto al gruppo sottoposto a intervento simulato, i livelli di espressione di IL-4, IL-17 e IFN-γ nel gruppo ME sono aumentati solo leggermente e non hanno raggiunto la significatività statistica (P > 0,05).
L'espressione dell'mRNA di IL-4, IL-17 e IFN-γ nel gruppo NPE ha mostrato un andamento significativamente più elevato rispetto a quello del gruppo sottoposto a intervento simulato e del gruppo ME (P < 0,05).
Al contrario, i livelli di espressione nel gruppo ME non hanno mostrato differenze significative (P>0,05).
L'analisi Western blot è stata eseguita utilizzando anticorpi disponibili in commercio contro IL-4 e IL-17 per confermare il pattern di espressione dell'mRNA alterato. Come mostrato nelle Figure 5A,B, rispetto al gruppo ME e al gruppo sottoposto a intervento simulato, i livelli proteici di IL-4 e IL-17 nel gruppo NPE sono risultati significativamente aumentati (P < 0,05). Rispetto al gruppo sottoposto a intervento simulato, anche i livelli proteici di IL-4 e IL-17 nel gruppo ME non hanno raggiunto variazioni statisticamente significative (P > 0,05).
(A) I livelli proteici di IL-4 e IL-17 nel gruppo NPE erano significativamente più alti rispetto a quelli del gruppo ME e del gruppo placebo (P < 0,05). (B) Istogramma del Western blot.
A causa del numero limitato di campioni umani ottenuti durante gli interventi chirurgici, studi chiari e dettagliati sulla patogenesi della MC risultano piuttosto difficili. Abbiamo tentato di stabilire un modello animale di MC per studiarne i potenziali meccanismi patologici. Allo stesso tempo, sono state utilizzate valutazioni radiologiche, istologiche e di biologia molecolare per seguire il decorso della MC indotta dall'autotrapianto di NP. Di conseguenza, il modello di impianto di NP ha determinato una graduale variazione dell'intensità del segnale tra le 12 e le 20 settimane (segnale basso misto nelle sequenze T1W e segnale basso nelle sequenze T2W), indicando cambiamenti tissutali, e le valutazioni istologiche e di biologia molecolare hanno confermato i risultati dello studio radiologico.
I risultati di questo esperimento mostrano che nel gruppo NPE si sono verificati cambiamenti visivi e istologici nel sito di lesione del corpo vertebrale. Allo stesso tempo, è stata osservata l'espressione dei geni IL-4, IL-17 e IFN-γ, indicando che la lesione del tessuto del nucleo polposo autologo nel corpo vertebrale può causare una serie di cambiamenti di segnale e morfologici. È facile constatare che le caratteristiche del segnale dei corpi vertebrali del modello animale (segnale basso nella sequenza T1W, segnale misto e basso nella sequenza T2W) sono molto simili a quelle delle cellule vertebrali umane, e le caratteristiche della risonanza magnetica confermano anche le osservazioni istologiche e di anatomia macroscopica, ovvero i cambiamenti nelle cellule del corpo vertebrale sono progressivi. Sebbene la risposta infiammatoria causata da un trauma acuto possa manifestarsi subito dopo la puntura, i risultati della risonanza magnetica hanno mostrato che cambiamenti di segnale progressivamente crescenti sono comparsi 12 settimane dopo la puntura e sono persistiti fino a 20 settimane senza alcun segno di recupero o inversione dei cambiamenti rilevati dalla risonanza magnetica. Questi risultati suggeriscono che il trapianto autologo di midollo spinale vertebrale è un metodo affidabile per indurre una microvascolarizzazione progressiva nei conigli.
Questo modello di puntura richiede abilità, tempo e impegno chirurgico adeguati. In esperimenti preliminari, la dissezione o l'eccessiva stimolazione delle strutture legamentose paravertebrali possono provocare la formazione di osteofiti vertebrali. Bisogna fare attenzione a non danneggiare o irritare i dischi adiacenti. Poiché la profondità di penetrazione deve essere controllata per ottenere risultati coerenti e riproducibili, abbiamo creato manualmente un tappo tagliando la guaina di un ago lungo 3 mm. L'utilizzo di questo tappo garantisce una profondità di perforazione uniforme nel corpo vertebrale. In esperimenti preliminari, tre chirurghi ortopedici coinvolti nell'operazione hanno riscontrato che gli aghi da 16 gauge sono più facili da usare rispetto agli aghi da 18 gauge o ad altri metodi. Per evitare un sanguinamento eccessivo durante la perforazione, tenere fermo l'ago per un certo periodo di tempo consente di ottenere un foro di inserimento più adatto, suggerendo che in questo modo è possibile controllare un certo grado di MC.
Sebbene molti studi si siano concentrati sulla MC, si sa poco sull'eziologia e la patogenesi della MC25,26,27. Sulla base dei nostri studi precedenti, abbiamo scoperto che l'autoimmunità gioca un ruolo chiave nell'insorgenza e nello sviluppo della MC12. Questo studio ha esaminato l'espressione quantitativa di IL-4, IL-17 e IFN-γ, che sono le principali vie di differenziazione delle cellule CD4+ dopo la stimolazione antigenica. Nel nostro studio, rispetto al gruppo negativo, il gruppo NPE ha mostrato una maggiore espressione di IL-4, IL-17 e IFN-γ, e anche i livelli proteici di IL-4 e IL-17 erano più elevati.
Clinicamente, l'espressione dell'mRNA di IL-17 è aumentata nelle cellule NP di pazienti con ernia del disco28. Livelli aumentati di espressione di IL-4 e IFN-γ sono stati riscontrati anche in un modello di ernia del disco acuta non compressiva rispetto ai controlli sani29. L'IL-17 svolge un ruolo chiave nell'infiammazione, nel danno tissutale nelle malattie autoimmuni30 e potenzia la risposta immunitaria all'IFN-γ31. Un danno tissutale mediato da IL-17 è stato riportato nei topi MRL/lpr32 e nei topi suscettibili all'autoimmunità33. L'IL-4 può inibire l'espressione di citochine proinfiammatorie (come IL-1β e TNFα) e l'attivazione dei macrofagi34. È stato riportato che l'espressione dell'mRNA di IL-4 era diversa nel gruppo NPE rispetto a IL-17 e IFN-γ nello stesso punto temporale; l'espressione dell'mRNA di IFN-γ nel gruppo NPE era significativamente più alta rispetto a quella negli altri gruppi. Pertanto, la produzione di IFN-γ potrebbe essere un mediatore della risposta infiammatoria indotta dall'intercalazione di NP. Studi hanno dimostrato che l'IFN-γ è prodotto da molteplici tipi cellulari, tra cui cellule T helper di tipo 1 attivate, cellule natural killer e macrofagi35,36, ed è una citochina pro-infiammatoria chiave che promuove le risposte immunitarie37.
Questo studio suggerisce che la risposta autoimmune potrebbe essere coinvolta nell'insorgenza e nello sviluppo della MC. Luoma et al. hanno scoperto che le caratteristiche del segnale della MC e del NP prominente sono simili alla risonanza magnetica, ed entrambi mostrano un segnale elevato nella sequenza T2W38. È stato confermato che alcune citochine sono strettamente associate all'insorgenza della MC, come l'IL-139. Ma et al. hanno suggerito che la protrusione verso l'alto o verso il basso del NP può avere una grande influenza sull'insorgenza e sullo sviluppo della MC12. Bobechko40 e Herzbein et al.41 hanno riportato che il NP è un tessuto immunotollerante che non può entrare nella circolazione vascolare dalla nascita. Le protrusioni del NP introducono corpi estranei nell'apporto sanguigno, mediando così reazioni autoimmuni locali42. Le reazioni autoimmuni possono indurre un gran numero di fattori immunitari e, quando questi fattori sono continuamente esposti ai tessuti, possono causare cambiamenti nella segnalazione43. In questo studio, la sovraespressione di IL-4, IL-17 e IFN-γ sono tipici fattori immunitari, a ulteriore riprova della stretta relazione tra NP e MCs44. Questo modello animale riproduce fedelmente la penetrazione del NP e l'ingresso nella placca terminale. Questo processo ha ulteriormente rivelato l'impatto dell'autoimmunità sui MC.
Come previsto, questo modello animale ci fornisce una possibile piattaforma per studiare la MC. Tuttavia, questo modello presenta ancora alcune limitazioni: in primo luogo, durante la fase di osservazione degli animali, alcuni conigli in fase intermedia devono essere soppressi per test istologici e di biologia molecolare, quindi alcuni animali "non sono più utilizzabili" nel tempo. In secondo luogo, sebbene in questo studio siano stati definiti tre punti temporali, purtroppo abbiamo modellato solo un tipo di MC (alterazione di tipo I di Modic), quindi non è sufficiente a rappresentare il processo di sviluppo della malattia umana, e sono necessari più punti temporali per osservare meglio tutte le variazioni del segnale. In terzo luogo, le modifiche nella struttura tissutale possono effettivamente essere chiaramente mostrate dalla colorazione istologica, ma alcune tecniche specializzate possono rivelare meglio le modifiche microstrutturali in questo modello. Ad esempio, la microscopia a luce polarizzata è stata utilizzata per analizzare la formazione di fibrocartilagine nei dischi intervertebrali di coniglio45. Gli effetti a lungo termine del NP sulla MC e sulla placca terminale richiedono ulteriori studi.
Cinquantaquattro conigli maschi bianchi della Nuova Zelanda (peso circa 2,5-3 kg, età 3-3,5 mesi) sono stati suddivisi casualmente in tre gruppi: gruppo di intervento simulato, gruppo di impianto muscolare (gruppo ME) e gruppo di impianto di radice nervosa (gruppo NPE). Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato Etico dell'Ospedale di Tianjin e i metodi sperimentali sono stati eseguiti in stretta conformità con le linee guida approvate.
Sono stati apportati alcuni miglioramenti alla tecnica chirurgica di S. Sobajima 46. Ogni coniglio è stato posizionato in decubito laterale e la superficie anteriore di cinque dischi intervertebrali lombari (IVD) consecutivi è stata esposta mediante un approccio retroperitoneale posterolaterale. A ciascun coniglio è stata somministrata anestesia generale (uretano al 20%, 5 ml/kg tramite la vena auricolare). È stata praticata un'incisione cutanea longitudinale dal bordo inferiore delle costole al margine pelvico, 2 cm ventralmente ai muscoli paravertebrali. La colonna vertebrale anterolaterale destra da L1 a L6 è stata esposta mediante dissezione tagliente e smussa del tessuto sottocutaneo sovrastante, del tessuto retroperitoneale e dei muscoli (Fig. 6A). Il livello del disco è stato determinato utilizzando il margine pelvico come punto di riferimento anatomico per il livello del disco L5-L6. Utilizzare un ago da puntura da 16 gauge per praticare un foro vicino alla placca terminale della vertebra L5 a una profondità di 3 mm (Fig. 6B). Utilizzare una siringa da 5 ml per aspirare il nucleo polposo autologo dal disco intervertebrale L1-L2 (Fig. 6C). Rimuovere il nucleo polposo o il muscolo a seconda delle esigenze di ciascun gruppo. Dopo aver approfondito il foro di perforazione, posizionare suture riassorbibili sulla fascia profonda, sulla fascia superficiale e sulla cute, facendo attenzione a non danneggiare il tessuto periostale del corpo vertebrale durante l'intervento chirurgico.
(A) Il disco L5-L6 viene esposto tramite un approccio retroperitoneale posterolaterale. (B) Si utilizza un ago da 16 gauge per praticare un foro vicino alla placca terminale di L5. (C) Vengono prelevati i fibroblasti autologhi.
L'anestesia generale è stata somministrata con uretano al 20% (5 ml/kg) tramite vena auricolare e le radiografie della colonna lombare sono state ripetute a 12, 16 e 20 settimane dall'intervento.
I conigli sono stati sacrificati mediante iniezione intramuscolare di ketamina (25,0 mg/kg) e pentobarbital sodico per via endovenosa (1,2 g/kg) a 12, 16 e 20 settimane dall'intervento chirurgico. L'intera colonna vertebrale è stata rimossa per l'analisi istologica ed è stata eseguita un'analisi reale. La trascrizione inversa quantitativa (RT-qPCR) e il Western blotting sono stati utilizzati per rilevare le variazioni dei fattori immunitari.
Gli esami di risonanza magnetica (RM) sono stati eseguiti su conigli utilizzando un magnete clinico da 3,0 T (GE Medical Systems, Florence, SC) dotato di una bobina ricevente ortogonale per gli arti. I conigli sono stati anestetizzati con uretano al 20% (5 mL/kg) tramite la vena auricolare e quindi posizionati supini all'interno del magnete con la regione lombare centrata su una bobina di superficie circolare di 5 pollici di diametro (GE Medical Systems). Sono state acquisite immagini di localizzazione coronali pesate in T2 (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) per definire la posizione del disco lombare da L3-L4 a L5-L6. Le sezioni sagittali pesate in T2 sono state acquisite con le seguenti impostazioni: sequenza fast spin-echo con un tempo di ripetizione (TR) di 2200 ms e un tempo di eco (TE) di 70 ms, matrice; campo visivo di 260 e otto stimoli; lo spessore di taglio era di 2 mm, il gap era di 0,2 mm.
Dopo aver scattato l'ultima fotografia e aver sacrificato l'ultimo coniglio, i dischi di controllo (sham), quelli inclusi nel muscolo e quelli NP sono stati rimossi per l'esame istologico. I tessuti sono stati fissati in formalina tamponata neutra al 10% per una settimana, decalcificati con acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e sezionati in paraffina. I blocchi di tessuto sono stati inclusi in paraffina e tagliati in sezioni sagittali (spessore 5 μm) utilizzando un microtomo. Le sezioni sono state colorate con ematossilina ed eosina (H&E).
Dopo aver raccolto i dischi intervertebrali dai conigli di ciascun gruppo, l'RNA totale è stato estratto utilizzando una colonna UNIQ-10 (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Cina) secondo le istruzioni del produttore e un sistema di retrotrascrizione ImProm II (Promega Inc., Madison, WI, USA). È stata eseguita la retrotrascrizione.
La RT-qPCR è stata eseguita utilizzando un Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., USA) e SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) secondo le istruzioni del produttore. Il volume della reazione PCR era di 20 μl e conteneva 1,5 μl di cDNA diluito e 0,2 μM di ciascun primer. I primer sono stati progettati con OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) e prodotti da Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Cina) (Tabella 1). Sono state utilizzate le seguenti condizioni di termociclaggio: fase iniziale di attivazione della polimerasi a 94 °C per 2 min, seguita da 40 cicli di 15 s ciascuno a 94 °C per la denaturazione del template, annealing per 1 min a 60 °C, estensione e misurazione della fluorescenza. Le misurazioni sono state eseguite per 1 min a 72 °C. Tutti i campioni sono stati amplificati tre volte e il valore medio è stato utilizzato per l'analisi RT-qPCR. I dati di amplificazione sono stati analizzati utilizzando FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). L'espressione genica di IL-4, IL-17 e IFN-γ è stata normalizzata rispetto al controllo endogeno (ACTB). I livelli di espressione relativa dell'mRNA target sono stati calcolati utilizzando il metodo 2-ΔΔCT.
Le proteine totali sono state estratte dai tessuti utilizzando un omogeneizzatore tissutale in tampone di lisi RIPA (contenente un cocktail di inibitori di proteasi e fosfatasi) e quindi centrifugate a 13.000 rpm per 20 min a 4°C per rimuovere i detriti tissutali. Cinquanta microgrammi di proteine sono stati caricati per corsia, separati mediante SDS-PAGE al 10% e quindi trasferiti su una membrana PVDF. Il blocco è stato eseguito in latte scremato in polvere al 5% in soluzione salina tamponata con Tris (TBS) contenente Tween 20 allo 0,1% per 1 ora a temperatura ambiente. La membrana è stata incubata con anticorpo primario anti-decorina di coniglio (diluito 1:200; Boster, Wuhan, Cina) (diluito 1:200; Bioss, Pechino, Cina) per una notte a 4°C e fatta reagire il secondo giorno; con anticorpo secondario (immunoglobulina G di capra anti-coniglio a diluizione 1:40.000) combinato con perossidasi di rafano (Boster, Wuhan, Cina) per 1 ora a temperatura ambiente. I segnali del Western blot sono stati rilevati dall'aumento della chemiluminescenza sulla membrana chemiluminescente dopo irradiazione a raggi X. Per l'analisi densitometrica, i blot sono stati scansionati e quantificati utilizzando il software BandScan e i risultati sono stati espressi come rapporto tra l'immunoreattività del gene target e l'immunoreattività della tubulina.
I calcoli statistici sono stati eseguiti utilizzando il pacchetto software SPSS 16.0 (SPSS, USA). I dati raccolti durante lo studio sono stati espressi come media ± deviazione standard (media ± DS) e analizzati mediante analisi della varianza a una via per misure ripetute (ANOVA) per determinare le differenze tra i due gruppi. Un valore di P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
Pertanto, la creazione di un modello animale di MC mediante l'impianto di NP autologhi nel corpo vertebrale e l'esecuzione di osservazioni macroanatomiche, analisi di risonanza magnetica, valutazione istologica e analisi di biologia molecolare potrebbe diventare uno strumento importante per valutare e comprendere i meccanismi della MC umana e sviluppare nuovi interventi terapeutici.
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Data di pubblicazione: 13 dicembre 2024