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Il muscolo scheletrico è un tessuto eterogeneo composto prevalentemente da miofibrille, che nell'uomo vengono tipicamente classificate in tre tipi: una "lenta" (tipo 1) e due "veloci" (tipi 2A e 2X). Tuttavia, l'eterogeneità tra e all'interno dei tipi tradizionali di miofibrille rimane poco compresa. Abbiamo applicato approcci trascrittomici e proteomici rispettivamente a 1050 e 1038 singole miofibrille del vasto laterale umano. Lo studio proteomico ha incluso soggetti di sesso maschile, mentre lo studio trascrittomico ha incluso 10 uomini e 2 donne. Oltre alle isoforme della catena pesante della miosina, abbiamo identificato proteine metaboliche, proteine ribosomiali e proteine delle giunzioni cellulari come fonti di variabilità intermiofibrillare multidimensionale. Inoltre, nonostante l'identificazione di cluster di fibre lente e veloci, i nostri dati suggeriscono che le fibre di tipo 2X siano fenotipicamente indistinguibili dalle altre fibre a contrazione rapida. Inoltre, la classificazione basata sulla catena pesante della miosina è insufficiente a descrivere il fenotipo delle miofibre nelle miopatie nemaliniche. Nel complesso, i nostri dati suggeriscono un'eterogeneità multidimensionale delle miofibre, con fonti di variazione che si estendono oltre le isoforme della catena pesante della miosina.
L'eterogeneità cellulare è una caratteristica intrinseca di tutti i sistemi biologici, che permette alle cellule di specializzarsi per soddisfare le diverse esigenze dei tessuti e delle cellule.1 La visione tradizionale dell'eterogeneità delle fibre muscolari scheletriche è che i motoneuroni definiscano il tipo di fibra all'interno di un'unità motoria e che il tipo di fibra (ad esempio, tipo 1, tipo 2A e tipo 2X negli esseri umani) sia determinato dalle caratteristiche delle isoforme della catena pesante della miosina (MYH).2 Inizialmente, ciò si basava sulla loro instabilità dell'ATPasi pH3,4 e successivamente sulla loro espressione molecolare di MYH.5 Tuttavia, con l'identificazione e la successiva accettazione delle fibre "miste" che co-esprimono più MYH in proporzioni variabili, le fibre muscolari scheletriche sono sempre più considerate come un continuum piuttosto che come tipi di fibra distinti.6 Nonostante ciò, il campo si basa ancora fortemente su MYH come principale classificatore per la classificazione delle miofibre, una visione probabilmente influenzata dai limiti e dai significativi bias dei primi studi sui roditori, i cui profili di espressione di MYH e la gamma di tipi di fibra differiscono da quelle presenti negli esseri umani.² La situazione è ulteriormente complicata dal fatto che i diversi muscoli scheletrici umani presentano una vasta gamma di tipi di fibre.⁷ Il vasto laterale è un muscolo misto con un profilo di espressione di MYH intermedio (e quindi rappresentativo).⁷ Inoltre, la facilità di prelievo dei campioni lo rende il muscolo più studiato negli esseri umani.
Pertanto, un'indagine imparziale sulla diversità delle fibre muscolari scheletriche mediante potenti strumenti "omici" è fondamentale ma anche impegnativa, in parte a causa della natura multinucleata delle fibre muscolari scheletriche. Tuttavia, le tecnologie di trascrittomica8,9 e proteomica10 hanno subito una rivoluzione in termini di sensibilità negli ultimi anni grazie a diversi progressi tecnologici, che consentono l'analisi del muscolo scheletrico a livello di singola fibra. Di conseguenza, sono stati compiuti progressi significativi nella caratterizzazione della diversità delle singole fibre e della loro risposta agli stimoli atrofici e all'invecchiamento11,12,13,14,15,16,17,18. È importante sottolineare che questi progressi tecnologici hanno applicazioni cliniche, consentendo una caratterizzazione più dettagliata e precisa della disregolazione associata alla malattia. Ad esempio, la fisiopatologia della miopatia nemalinica, una delle malattie muscolari ereditarie più comuni (MIM 605355 e MIM 161800), è complessa e di difficile interpretazione.19,20 Pertanto, una migliore caratterizzazione della disregolazione delle fibre muscolari scheletriche potrebbe portare a progressi significativi nella nostra comprensione di questa malattia.
Abbiamo sviluppato metodi per l'analisi trascrittomica e proteomica di singole fibre muscolari scheletriche isolate manualmente da campioni bioptici umani e li abbiamo applicati a migliaia di fibre, consentendoci di studiare l'eterogeneità cellulare delle fibre muscolari scheletriche umane. Nel corso di questo lavoro, abbiamo dimostrato la potenza della fenotipizzazione trascrittomica e proteomica delle fibre muscolari e identificato proteine metaboliche, ribosomiali e delle giunzioni cellulari come fonti significative di variabilità interfibra. Inoltre, utilizzando questo flusso di lavoro proteomico, abbiamo caratterizzato la rilevanza clinica della miopatia da nematodi nelle singole fibre muscolari scheletriche, rivelando uno spostamento coordinato verso fibre non ossidative indipendentemente dal tipo di fibra basato su MYH.
Per studiare l'eterogeneità delle fibre muscolari scheletriche umane, abbiamo sviluppato due flussi di lavoro per consentire l'analisi del trascrittoma e del proteoma di singole fibre muscolari scheletriche (Figura 1A e Figura supplementare 1A). Abbiamo sviluppato e ottimizzato diverse fasi metodologiche, dalla conservazione del campione e dalla preservazione dell'integrità di RNA e proteine all'ottimizzazione del throughput per ciascun approccio. Per l'analisi del trascrittoma, ciò è stato ottenuto inserendo codici a barre molecolari specifici per il campione nella fase iniziale della retrotrascrizione, consentendo di raggruppare 96 fibre per un'efficiente elaborazione a valle. Un sequenziamento più profondo (±1 milione di letture per fibra) rispetto agli approcci tradizionali a singola cellula ha ulteriormente arricchito i dati del trascrittoma. 21 Per la proteomica, abbiamo utilizzato un gradiente cromatografico breve (21 minuti) combinato con l'acquisizione di dati DIA-PASEF su uno spettrometro di massa timsTOF per ottimizzare la profondità del proteoma mantenendo un throughput elevato. 22,23 Per studiare l'eterogeneità delle fibre muscolari scheletriche sane, abbiamo caratterizzato i trascrittomi di 1.050 singole fibre provenienti da 14 donatori adulti sani e i proteomi di 1.038 fibre provenienti da 5 donatori adulti sani (Tabella supplementare 1). In questo articolo, questi set di dati sono indicati rispettivamente come trascrittomi e proteomi di 1.000 fibre. Il nostro approccio ha rilevato un totale di 27.237 trascritti e 2.983 proteine nelle analisi trascrittomiche e proteomiche di 1.000 fibre (Figura 1A, Set di dati supplementari 1-2). Dopo aver filtrato i set di dati trascrittomici e proteomici per >1.000 geni rilevati e il 50% di valori validi per fibra, sono state eseguite successive analisi bioinformatiche per 925 e 974 fibre rispettivamente nel trascrittoma e nel proteoma. Dopo il filtraggio, sono stati rilevati in media 4257 ± 1557 geni e 2015 ± 234 proteine (media ± DS) per fibra, con una variabilità interindividuale limitata (Figure supplementari 1B-C, Set di dati supplementari 3-4). Tuttavia, la variabilità intra-soggetto era più pronunciata tra i partecipanti, probabilmente a causa delle differenze nella resa di RNA/proteine tra fibre di diversa lunghezza e area trasversale. Per la maggior parte delle proteine (>2000), il coefficiente di variazione era inferiore al 20% (Figura supplementare 1D). Entrambi i metodi hanno permesso di catturare un'ampia gamma dinamica di trascritti e proteine con firme altamente espresse importanti per la contrazione muscolare (ad esempio, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Figure supplementari 1E-F). La maggior parte delle caratteristiche identificate erano comuni tra i set di dati trascrittomici e proteomici (Figura supplementare 1G) e le intensità medie UMI/LFQ di queste caratteristiche erano ragionevolmente ben correlate (r = 0,52) (Figura supplementare 1H).
Flusso di lavoro di trascrittomica e proteomica (creato con BioRender.com). BD Curve di intervallo dinamico per MYH7, MYH2 e MYH1 e soglie calcolate per l'assegnazione del tipo di fibra. E, F Distribuzione dell'espressione di MYH tra le fibre nei set di dati di trascrittomica e proteomica. G, H Grafici UMAP (Uniform Diversity Approximation and Projection) per trascrittomica e proteomica colorati in base al tipo di fibra basato su MYH. I, J Grafici delle caratteristiche che mostrano l'espressione di MYH7, MYH2 e MYH1 nei set di dati di trascrittomica e proteomica.
Inizialmente, ci siamo proposti di assegnare a ciascuna fibra un tipo di fibra basato su MYH utilizzando un approccio ottimizzato che sfrutta l'elevata sensibilità e la gamma dinamica dell'espressione di MYH nei set di dati omici. Studi precedenti hanno utilizzato soglie arbitrarie per etichettare le fibre come di tipo 1 puro, tipo 2A, tipo 2X o miste in base a una percentuale fissa di espressione di diversi MYH11,14,24. Abbiamo utilizzato un approccio diverso in cui l'espressione di ciascuna fibra è stata classificata in base ai MYH che abbiamo utilizzato per tipizzare le fibre: MYH7, MYH2 e MYH1, corrispondenti rispettivamente alle fibre di tipo 1, tipo 2A e tipo 2X. Abbiamo quindi calcolato matematicamente il punto di flesso inferiore di ciascuna curva risultante e lo abbiamo utilizzato come soglia per assegnare le fibre come positive (sopra la soglia) o negative (sotto la soglia) per ciascun MYH (Figura 1B-D). Questi dati dimostrano che MYH7 (Figura 1B) e MYH2 (Figura 1C) presentano profili di espressione on/off più distinti a livello di RNA rispetto al livello proteico. Infatti, a livello proteico, pochissime fibre non esprimevano MYH7 e nessuna fibra presentava un'espressione di MYH2 del 100%. Abbiamo quindi utilizzato soglie di espressione predeterminate per assegnare i tipi di fibre basati su MYH a tutte le fibre in ciascun set di dati. Ad esempio, le fibre MYH7+/MYH2-/MYH1- sono state assegnate al tipo 1, mentre le fibre MYH7-/MYH2+/MYH1+ sono state assegnate al tipo misto 2A/2X (vedere la Tabella supplementare 2 per una descrizione completa). Raggruppando tutte le fibre, abbiamo osservato una distribuzione notevolmente simile dei tipi di fibre basati su MYH sia a livello di RNA (Figura 1E) che di proteine (Figura 1F), mentre la composizione relativa dei tipi di fibre basati su MYH variava tra gli individui, come previsto (Figura supplementare 2A). La maggior parte delle fibre è stata classificata come di tipo 1 puro (34-35%) o di tipo 2A (36-38%), sebbene sia stato rilevato anche un numero significativo di fibre miste di tipo 2A/2X (16-19%). Una differenza notevole è che le fibre di tipo 2X puro sono state rilevate solo a livello di RNA, ma non a livello proteico, suggerendo che la rapida espressione di MYH sia almeno in parte regolata a livello post-trascrizionale.
Abbiamo convalidato il nostro metodo di tipizzazione delle fibre MYH basato sulla proteomica utilizzando il dot blotting basato su anticorpi, ed entrambi i metodi hanno raggiunto una concordanza del 100% nell'identificazione di fibre pure di tipo 1 e di tipo 2A (vedere Figura supplementare 2B). Tuttavia, l'approccio basato sulla proteomica si è dimostrato più sensibile, più efficiente nell'identificazione di fibre miste e nella quantificazione della proporzione di ciascun gene MYH in ogni fibra. Questi dati dimostrano l'efficacia dell'utilizzo di un approccio oggettivo, altamente sensibile e basato sull'omica per caratterizzare i tipi di fibre muscolari scheletriche.
Abbiamo quindi utilizzato le informazioni combinate fornite dalla trascrittomica e dalla proteomica per classificare oggettivamente le miofibre in base al loro trascrittoma o proteoma completo. Utilizzando il metodo di approssimazione e proiezione uniforme della varietà (UMAP) per ridurre la dimensionalità a sei componenti principali (Figure supplementari 3A-B), siamo stati in grado di visualizzare la variabilità delle miofibre nel trascrittoma (Figura 1G) e nel proteoma (Figura 1H). In particolare, le miofibre non sono state raggruppate per partecipanti (Figure supplementari 3C-D) o giorni di test (Figura supplementare 3E) in nessuno dei set di dati trascrittomici o proteomici, suggerendo che la variabilità intra-soggetto nelle fibre muscolari scheletriche è maggiore della variabilità inter-soggetto. Nel grafico UMAP, sono emersi due cluster distinti che rappresentano le miofibre "veloci" e "lente" (Figure 1G-H). Le miofibre MYH7+ (lente) erano raggruppate al polo positivo di UMAP1, mentre le miofibre MYH2+ e MYH1+ (veloci) erano raggruppate al polo negativo di UMAP1 (Figure 1I–J). Tuttavia, non è stata fatta alcuna distinzione tra i tipi di fibre a contrazione rapida (ovvero, tipo 2A, tipo 2X o misto 2A/2X) in base all'espressione di MYH, suggerendo che l'espressione di MYH1 (Figure 1I–J) o di altri marcatori classici delle miofibre 2X come ACTN3 o MYLK2 (Figure supplementari 4A–B) non differenzia tra i diversi tipi di miofibre quando si considera l'intero trascrittoma o proteoma. Inoltre, rispetto a MYH2 e MYH7, pochi trascritti o proteine mostravano una correlazione positiva con MYH1 (Figure supplementari 4C-H), suggerendo che l'abbondanza di MYH1 non riflette completamente il trascrittoma/proteoma della miofibra. Conclusioni simili sono state raggiunte valutando l'espressione mista delle tre isoforme di MYH a livello UMAP (Figure supplementari 4I-J). Pertanto, mentre le fibre 2X possono essere identificate a livello di trascritto basandosi esclusivamente sulla quantificazione di MYH, le fibre MYH1+ non sono distinguibili dalle altre fibre veloci se si considera l'intero trascrittoma o proteoma.
Come esplorazione iniziale dell'eterogeneità delle fibre lente al di là di MYH, abbiamo valutato quattro proteine note per essere specifiche del tipo di fibra lenta: TPM3, TNNT1, MYL3 e ATP2A22. I sottotipi di fibre lente hanno mostrato correlazioni di Pearson elevate, sebbene non perfette, con MYH7 sia nella trascrittomica (Figura supplementare 5A) che nella proteomica (Figura supplementare 5B). Circa il 25% e il 33% delle fibre lente non sono state classificate come fibre lente pure da tutti i sottotipi genici/proteici nella trascrittomica (Figura supplementare 5C) e nella proteomica (Figura supplementare 5D), rispettivamente. Pertanto, la classificazione delle fibre lente basata su molteplici sottotipi genici/proteici introduce un'ulteriore complessità, anche per le proteine note per essere specifiche del tipo di fibra. Ciò suggerisce che la classificazione delle fibre basata su isoforme di una singola famiglia genica/proteica potrebbe non riflettere adeguatamente la vera eterogeneità delle fibre muscolari scheletriche.
Per esplorare ulteriormente la variabilità fenotipica delle fibre muscolari scheletriche umane su scala dell'intero modello omico, abbiamo eseguito una riduzione di dimensionalità imparziale dei dati utilizzando l'analisi delle componenti principali (PCA) (Figura 2A). Analogamente ai grafici UMAP, né il partecipante né il giorno del test hanno influenzato il clustering delle fibre a livello PCA (Figure supplementari 6A-C). In entrambi i set di dati, il tipo di fibra basato su MYH è stato spiegato da PC2, che ha mostrato un cluster di fibre a contrazione lenta di tipo 1 e un secondo cluster contenente fibre a contrazione rapida di tipo 2A, tipo 2X e fibre miste 2A/2X (Figura 2A). In entrambi i set di dati, questi due cluster erano collegati da un piccolo numero di fibre miste di tipo 1/2A. Come previsto, l'analisi di sovrarappresentazione dei principali driver PC ha confermato che PC2 era guidato da firme contrattili e metaboliche (Figura 2B e Figure supplementari 6D-E, Set di dati supplementari 5-6). Nel complesso, si è constatato che il tipo di fibra basato su MYH era sufficiente a spiegare la variazione continua lungo PC2, con l'eccezione delle cosiddette fibre 2X che erano distribuite in tutto il trascrittoma all'interno del cluster veloce.
A. Grafici dell'analisi delle componenti principali (PCA) dei set di dati del trascrittoma e del proteoma colorati in base al tipo di fibra basato su MYH. B. Analisi di arricchimento dei driver di trascrizione e proteina in PC2 e PC1. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il pacchetto clusterProfiler e i valori p corretti di Benjamini-Hochberg. C, D. Grafici PCA colorati in base ai termini di ontologia genica (GO) dell'adesione intercellulare nel trascrittoma e ai termini GO del costamero nel proteoma. Le frecce rappresentano i driver di trascrizione e proteina e le loro direzioni. E, F. Grafici delle caratteristiche di approssimazione e proiezione uniforme della manifold (UMAP) di caratteristiche clinicamente rilevanti che mostrano gradienti di espressione indipendenti dal tipo di fibra lenta/veloce. G, H. Correlazioni tra i driver PC2 e PC1 nei trascrittomi e nei proteomi.
Inaspettatamente, il tipo di miofibra basato su MYH ha spiegato solo il secondo grado più elevato di variabilità (PC2), suggerendo che altri fattori biologici non correlati al tipo di miofibra basato su MYH (PC1) svolgono un ruolo importante nella regolazione dell'eterogeneità delle fibre muscolari scheletriche. L'analisi di sovrarappresentazione dei principali driver in PC1 ha rivelato che la variabilità in PC1 era determinata principalmente dall'adesione cellula-cellula e dal contenuto di ribosomi nel trascrittoma, e dai costameri e dalle proteine ribosomiali nel proteoma (Figura 2B e Figure supplementari 6D-E, Set di dati supplementari 7). Nel muscolo scheletrico, i costameri collegano il disco Z al sarcolemma e sono coinvolti nella trasmissione della forza e nella segnalazione. 25 I grafici PCA annotati utilizzando le caratteristiche di adesione cellula-cellula (trascrittoma, Figura 2C) e costamero (proteoma, Figura 2D) hanno rivelato un forte spostamento a sinistra in PC1, indicando che queste caratteristiche sono arricchite in determinate fibre.
Un esame più dettagliato del clustering delle miofibre a livello UMAP ha rivelato che la maggior parte delle caratteristiche presentava un gradiente di espressione basato su MYH indipendente dal tipo di miofibra, piuttosto che specifico per il sottocluster di miofibre. Questa continuità è stata osservata per diversi geni associati a condizioni patologiche (Figura 2E), come CHCHD10 (malattia neuromuscolare), SLIT3 (atrofia muscolare), CTDNEP1 (malattia muscolare). Questa continuità è stata osservata anche nell'intero proteoma, comprese le proteine associate a disturbi neurologici (UGDH), segnalazione dell'insulina (PHIP) e trascrizione (HIST1H2AB) (Figura 2F). Nel complesso, questi dati indicano una continuità nell'eterogeneità delle fibre muscolari a contrazione lenta/rapida indipendente dal tipo di fibra attraverso diverse miofibre.
È interessante notare che i geni driver in PC2 hanno mostrato una buona correlazione trascrittoma-proteoma (r = 0,663) (Figura 2G), suggerendo che i tipi di fibre a contrazione lenta e rapida, e in particolare le proprietà contrattili e metaboliche delle fibre muscolari scheletriche, sono regolati a livello trascrizionale. Tuttavia, i geni driver in PC1 non hanno mostrato alcuna correlazione trascrittoma-proteoma (r = -0,027) (Figura 2H), suggerendo che le variazioni non correlate ai tipi di fibre a contrazione lenta/rapida sono in gran parte regolate a livello post-trascrizionale. Poiché le variazioni in PC1 erano principalmente spiegate dai termini di ontologia genica ribosomiale, e dato che i ribosomi svolgono un ruolo cruciale e specializzato nella cellula partecipando attivamente e influenzando la traduzione proteica,31 abbiamo quindi deciso di indagare questa inaspettata eterogeneità ribosomiale.
Abbiamo innanzitutto colorato il grafico dell'analisi delle componenti principali proteomiche in base all'abbondanza relativa delle proteine nel termine GOCC "ribosoma citoplasmatico" (Figura 3A). Sebbene questo termine sia arricchito sul lato positivo di PC1, risultando in un piccolo gradiente, le proteine ribosomiali guidano la partizione in entrambe le direzioni di PC1 (Figura 3A). Le proteine ribosomiali arricchite sul lato negativo di PC1 includevano RPL18, RPS18 e RPS13 (Figura 3B), mentre RPL31, RPL35 e RPL38 (Figura 3C) erano i principali driver sul lato positivo di PC1. È interessante notare che RPL38 e RPS13 erano altamente espresse nel muscolo scheletrico rispetto ad altri tessuti (Figura supplementare 7A). Queste firme ribosomiali distintive in PC1 non sono state osservate nel trascrittoma (Figura supplementare 7B), indicando una regolazione post-trascrizionale.
A. Grafico dell'analisi delle componenti principali (PCA) colorato in base ai termini di ontologia genica ribosomiale citoplasmatica (GO) nell'intero proteoma. Le frecce indicano la direzione della variazione mediata dalle proteine nel grafico PCA. La lunghezza della linea corrisponde al punteggio della componente principale per una data proteina. B, C. Grafici delle caratteristiche PCA per RPS13 e RPL38. D. Analisi di clustering gerarchico non supervisionato delle proteine ribosomiali citoplasmatiche. E. Modello strutturale del ribosoma 80S (PDB: 4V6X) che evidenzia le proteine ribosomiali con diversa abbondanza nelle fibre muscolari scheletriche. F. Proteine ribosomiali con diversa stechiometria localizzate vicino al canale di uscita dell'mRNA.
I concetti di eterogeneità e specializzazione ribosomiale sono stati proposti in precedenza, secondo i quali la presenza di distinte sottopopolazioni di ribosomi (eterogeneità ribosomiale) può influenzare direttamente la traduzione proteica in diversi tessuti32 e cellule33 attraverso la traduzione selettiva di specifici pool di trascritti di mRNA34 (specializzazione ribosomiale). Per identificare le sottopopolazioni di proteine ribosomiali co-espresse nelle fibre muscolari scheletriche, abbiamo eseguito un'analisi di clustering gerarchico non supervisionato delle proteine ribosomiali nel proteoma (Figura 3D, Set di dati supplementari 8). Come previsto, le proteine ribosomiali non si sono raggruppate per tipo di fibra in base a MYH. Tuttavia, abbiamo identificato tre cluster distinti di proteine ribosomiali; il primo cluster (ribosomal_cluster_1) è co-regolato con RPL38 e quindi presenta un'espressione aumentata nelle fibre con un profilo PC1 positivo. Il secondo cluster (ribosomal_cluster_2) è coregolato con RPS13 ed è elevato nelle fibre con un profilo PC1 negativo. Il terzo cluster (ribosomal_cluster_3) non mostra un'espressione differenziale coordinata nelle fibre muscolari scheletriche e può essere considerato la proteina ribosomiale "centrale" del muscolo scheletrico. Entrambi i cluster ribosomiali 1 e 2 contengono proteine ribosomiali che in precedenza hanno dimostrato di regolare la traduzione alternativa (ad esempio, RPL10A, RPL38, RPS19 e RPS25) e di influenzare funzionalmente lo sviluppo (ad esempio, RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 In linea con i risultati della PCA, la rappresentazione eterogenea osservata di queste proteine ribosomiali attraverso le fibre ha mostrato anche continuità (Figura supplementare 7C).
Per visualizzare la localizzazione delle proteine ribosomiali eterogenee all'interno del ribosoma, abbiamo utilizzato un modello strutturale del ribosoma umano 80S (Protein Data Bank: 4V6X) (Figura 3E). Dopo aver isolato le proteine ribosomiali appartenenti a diversi cluster ribosomiali, le loro posizioni non risultavano strettamente allineate, suggerendo che il nostro approccio non è riuscito a fornire un arricchimento per determinate regioni/frazioni del ribosoma. È interessante notare, tuttavia, che la proporzione di proteine della subunità maggiore nel cluster 2 era inferiore rispetto ai cluster 1 e 3 (Figura supplementare 7D). Abbiamo osservato che le proteine con stechiometria alterata nelle fibre muscolari scheletriche erano prevalentemente localizzate sulla superficie del ribosoma (Figura 3E), in linea con la loro capacità di interagire con gli elementi IRES (Internal Ribosome Entry Site) in diverse popolazioni di mRNA, coordinando così la traduzione selettiva. 40, 41 Inoltre, molte proteine con stechiometria alterata nelle fibre muscolari scheletriche erano localizzate vicino a regioni funzionali come il tunnel di uscita dell'mRNA (Figura 3F), che regolano selettivamente l'allungamento traslazionale e l'arresto di peptidi specifici. 42 In sintesi, i nostri dati suggeriscono che la stechiometria delle proteine ribosomiali del muscolo scheletrico presenta eterogeneità, con conseguenti differenze tra le fibre muscolari scheletriche.
Abbiamo quindi cercato di identificare le firme delle fibre a contrazione rapida e lenta ed esplorare i meccanismi della loro regolazione trascrizionale. Confrontando i cluster di fibre a contrazione rapida e lenta definiti da UMAP nei due set di dati (Figure 1G–H e 4A–B), le analisi trascrittomiche e proteomiche hanno identificato rispettivamente 1366 e 804 caratteristiche con abbondanza differenziale (Figure 4A–B, Set di dati supplementari 9–12). Abbiamo osservato le differenze attese nelle firme relative ai sarcomeri (ad esempio, tropomiosina e troponina), all'accoppiamento eccitazione-contrazione (isoforme SERCA) e al metabolismo energetico (ad esempio, ALDOA e CKB). Inoltre, i trascritti e le proteine che regolano l'ubiquitinazione proteica erano espressi in modo differenziale nelle fibre a contrazione rapida e lenta (ad esempio, USP54, SH3RF2, USP28 e USP48) (Figure 4A–B). Inoltre, il gene della proteina microbica RP11-451G4.2 (DWORF), che in precedenza si è dimostrato essere espresso in modo differenziale nei diversi tipi di fibre muscolari di agnello43 e che potenzia l'attività SERCA nel muscolo cardiaco44, è risultato significativamente sovraregolato nelle fibre muscolari scheletriche lente (Figura 4A). Analogamente, a livello di singola fibra, sono state osservate differenze significative in firme note come le isoforme della lattato deidrogenasi correlate al metabolismo (LDHA e LDHB, Figura 4C e Figura supplementare 8A)45,46, nonché firme specifiche per tipo di fibra precedentemente sconosciute (come IRX3, USP54, USP28 e DPYSL3) (Figura 4C). Vi è stata una significativa sovrapposizione di caratteristiche espresse in modo differenziale tra i set di dati trascrittomici e proteomici (Figura supplementare 8B), nonché una correlazione del fold change guidata principalmente dalla più pronunciata espressione differenziale delle caratteristiche del sarcomero (Figura supplementare 8C). In particolare, alcune firme (ad esempio USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) hanno mostrato una forte regolazione post-trascrizionale solo a livello proteomico e presentavano profili di espressione specifici per tipo di fibra a contrazione lenta/veloce (Figura supplementare 8C).
A e B Grafici a vulcano che confrontano i cluster lenti e veloci identificati dai grafici di approssimazione e proiezione uniforme della varietà (UMAP) nelle Figure 1G-H. I punti colorati rappresentano trascritti o proteine che sono significativamente diversi a FDR < 0,05, e i punti più scuri rappresentano trascritti o proteine che sono significativamente diversi a log change > 1. L'analisi statistica a due vie è stata eseguita utilizzando il test DESeq2 Wald con valori p corretti di Benjamini-Hochberg (trascrittomica) o il metodo del modello lineare Limma con analisi bayesiana empirica seguita dalla correzione di Benjamini-Hochberg per confronti multipli (proteomica). C Grafici di firma di geni o proteine differenzialmente espressi selezionati tra fibre lente e veloci. D Analisi di arricchimento di trascritti e proteine significativamente differenzialmente espressi. I valori sovrapposti sono arricchiti in entrambi i set di dati, i valori del trascrittoma sono arricchiti solo nel trascrittoma e i valori del proteoma sono arricchiti solo nel proteoma. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il pacchetto clusterProfiler con valori p corretti secondo Benjamini-Hochberg. E. Fattori di trascrizione specifici per tipo di fibra identificati da SCENIC sulla base dei punteggi di specificità del regolatore derivati da SCENIC e dell'espressione differenziale dell'mRNA tra i tipi di fibra. F. Profilazione di fattori di trascrizione selezionati espressi in modo differenziale tra fibre lente e veloci.
Abbiamo quindi eseguito un'analisi di sovrarappresentazione dei geni e delle proteine rappresentati in modo differenziale (Figura 4D, Set di dati supplementari 13). L'arricchimento dei percorsi per le caratteristiche che differivano tra i due set di dati ha rivelato differenze attese, come i processi di β-ossidazione degli acidi grassi e del metabolismo dei chetoni (fibre lente), la contrazione dei miofilamenti/muscoli (fibre veloci e lente, rispettivamente) e i processi catabolici dei carboidrati (fibre veloci). Anche l'attività della proteina fosfatasi serina/treonina era elevata nelle fibre veloci, guidata da caratteristiche come le subunità fosfatasi regolatrici e catalitiche (PPP3CB, PPP1R3D e PPP1R3A), che sono note per regolare il metabolismo del glicogeno (47) (Figure supplementari 8D-E). Altri percorsi arricchiti nelle fibre veloci includevano i corpi di elaborazione (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) nel proteoma (Figura supplementare 8F), potenzialmente coinvolti nella regolazione post-trascrizionale (48), e l'attività del fattore di trascrizione (SREBF1, RXRG, RORA) nel trascrittoma (Figura supplementare 8G). Le fibre lente erano arricchite nell'attività ossidoreduttasica (BDH1, DCXR, TXN2) (Figura supplementare 8H), nel legame ammidico (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Figura supplementare 8I), nella matrice extracellulare (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Figura supplementare 8J) e nell'attività recettore-ligando (FNDC5, SPX, NENF) (Figura supplementare 8K).
Per ottenere ulteriori informazioni sulla regolazione trascrizionale alla base delle caratteristiche dei tipi di fibre muscolari lente/veloci, abbiamo eseguito un'analisi di arricchimento dei fattori di trascrizione utilizzando SCENIC49 (Set di dati supplementari 14). Molti fattori di trascrizione sono risultati significativamente arricchiti tra le fibre muscolari veloci e lente (Figura 4E). Tra questi, fattori di trascrizione come MAFA, precedentemente collegato allo sviluppo delle fibre muscolari veloci,50 così come diversi fattori di trascrizione non precedentemente associati a programmi genici specifici per tipo di fibra muscolare. Tra questi, PITX1, EGR1 e MYF6 sono risultati i fattori di trascrizione più arricchiti nelle fibre muscolari veloci (Figura 4E). Al contrario, ZSCAN30 ed EPAS1 (noto anche come HIF2A) sono risultati i fattori di trascrizione più arricchiti nelle fibre muscolari lente (Figura 4E). In linea con ciò, MAFA è stato espresso a livelli più elevati nella regione UMAP corrispondente alle fibre muscolari veloci, mentre EPAS1 ha mostrato un modello di espressione opposto (Figura 4F).
Oltre ai geni noti che codificano per proteine, esistono numerosi biotipi di RNA non codificante che possono essere coinvolti nella regolazione dello sviluppo umano e delle malattie. 51, 52 Nei set di dati del trascrittoma, diversi RNA non codificanti mostrano specificità per il tipo di fibra (Figura 5A e Set di dati supplementare 15), tra cui LINC01405, che è altamente specifico per le fibre lente e risulta diminuito nel muscolo di pazienti con miopatia mitocondriale. 53 Al contrario, RP11-255P5.3, corrispondente al gene lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, mostra specificità per il tipo di fibra veloce. Sia LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) che RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) mostrano specificità per il muscolo scheletrico (Figure supplementari 9A-B) e non hanno geni contrattili noti nel loro vicinato genomico di 1 Mb, suggerendo che svolgano un ruolo specializzato nella regolazione dei tipi di fibre piuttosto che nella regolazione dei geni contrattili vicini. I profili di espressione specifici per i tipi di fibre lente/veloci di LINC01405 e RP11-255P5.3, rispettivamente, sono stati confermati utilizzando RNAscope (Figure 5B-C).
A. I trascritti di RNA non codificante sono significativamente regolati nelle fibre muscolari a contrazione lenta e rapida. B. Immagini rappresentative di RNAscope che mostrano la specificità del tipo di fibra a contrazione lenta e rapida di LINC01405 e RP11-255P5.3, rispettivamente. Barra di scala = 50 μm. C. Quantificazione dell'espressione di RNA non codificante specifica per tipo di miofibra determinata mediante RNAscope (n = 3 biopsie da individui indipendenti, confrontando fibre muscolari rapide e lente all'interno di ciascun individuo). L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando un test t di Student a due code. I box plot mostrano la mediana e il primo e il terzo quartile, con i baffi che puntano ai valori minimi e massimi. D. Flusso di lavoro di identificazione de novo delle proteine microbiche (creato con BioRender.com). E. La proteina microbica LINC01405_ORF408:17441:17358 è espressa specificamente nelle fibre muscolari scheletriche lente (n=5 biopsie da partecipanti indipendenti, confrontando le fibre muscolari veloci e lente in ciascun partecipante). L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il metodo del modello lineare di Limm combinato con un approccio bayesiano empirico, seguito dal metodo di Benjamini-Hochberg per confronti multipli con aggiustamento del valore p. I box plot mostrano la mediana, il primo e il terzo quartile, con i baffi che puntano ai valori massimi/minimi.
Studi recenti hanno dimostrato che molti presunti trascritti non codificanti codificano proteine microbiche trascritte, alcune delle quali regolano la funzione muscolare. 44, 55 Per identificare le proteine microbiche con potenziale specificità per tipo di fibra, abbiamo cercato nel nostro dataset del proteoma di 1000 fibre utilizzando un file FASTA personalizzato contenente le sequenze dei trascritti non codificanti (n = 305) trovati nel dataset del trascrittoma di 1000 fibre (Figura 5D). Abbiamo identificato 197 proteine microbiche da 22 trascritti diversi, 71 dei quali erano regolati in modo differenziale tra fibre muscolari scheletriche lente e veloci (Figura supplementare 9C e Dataset supplementare 16). Per LINC01405, sono stati identificati tre prodotti proteici microbici, uno dei quali ha mostrato una specificità per le fibre lente simile al suo trascritto (Figura 5E e Figura supplementare 9D). Abbiamo quindi identificato LINC01405 come un gene che codifica una proteina microbica specifica per le fibre muscolari scheletriche lente.
Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro completo per la caratterizzazione proteomica su larga scala delle singole fibre muscolari e identificato i regolatori dell'eterogeneità delle fibre in condizioni di salute. Abbiamo applicato questo flusso di lavoro per comprendere come le miopatie nemaliniche influenzino l'eterogeneità delle fibre muscolari scheletriche. Le miopatie nemaliniche sono malattie muscolari ereditarie che causano debolezza muscolare e, nei bambini affetti, si presentano con una serie di complicazioni tra cui distress respiratorio, scoliosi e limitazione della mobilità degli arti. 19,20 Tipicamente, nelle miopatie nemaliniche, le varianti patogene in geni come l'actina alfa 1 (ACTA1) determinano una predominanza di fibre a contrazione lenta nella composizione delle miofibre, sebbene questo effetto sia eterogeneo. Un'eccezione notevole è la miopatia nemalinica da troponina T1 (TNNT1), che presenta una predominanza di fibre veloci. Pertanto, una migliore comprensione dell'eterogeneità alla base della disregolazione delle fibre muscolari scheletriche osservata nelle miopatie nemaliniche potrebbe contribuire a svelare la complessa relazione tra queste malattie e il tipo di miofibra.
Rispetto ai controlli sani (n=3 per gruppo), le miofibre isolate da pazienti affetti da miopatia nemalinica con mutazioni nei geni ACTA1 e TNNT1 hanno mostrato una marcata atrofia o distrofia delle miofibre (Figura 6A, Tabella supplementare 3). Ciò ha comportato significative difficoltà tecniche per l'analisi proteomica a causa della limitata quantità di materiale disponibile. Nonostante ciò, siamo stati in grado di rilevare 2485 proteine in 272 miofibre scheletriche. Dopo aver filtrato per almeno 1000 proteine quantificate per fibra, 250 fibre sono state sottoposte a successiva analisi bioinformatica. Dopo il filtraggio, sono state quantificate in media 1573 ± 359 proteine per fibra (Figura supplementare 10A, Set di dati supplementari 17-18). In particolare, nonostante la significativa riduzione delle dimensioni delle fibre, la profondità del proteoma dei campioni di pazienti affetti da miopatia nemalinica è risultata solo modestamente ridotta. Inoltre, l'elaborazione di questi dati utilizzando i nostri file FASTA (inclusi i trascritti non codificanti) ci ha permesso di identificare cinque proteine microbiche nelle miofibre scheletriche di pazienti affetti da miopatia nemalinica (Set di dati supplementari 19). La gamma dinamica del proteoma era significativamente più ampia e le proteine totali nel gruppo di controllo correlavano bene con i risultati di una precedente analisi del proteoma di 1000 fibre (Figura supplementare 10B-C).
A. Immagini microscopiche che mostrano atrofia o distrofia delle fibre e la predominanza di diversi tipi di fibre in base a MYH nelle miopatie nemaliniche ACTA1 e TNNT1 (NM). Barra di scala = 100 μm. Per garantire la riproducibilità della colorazione nei pazienti ACTA1 e TNNT1, tre biopsie di pazienti sono state colorate da due a tre volte (quattro sezioni per caso) prima di selezionare le immagini rappresentative. B. Proporzioni dei tipi di fibre nei partecipanti in base a MYH. C. Grafico dell'analisi delle componenti principali (PCA) delle fibre muscolari scheletriche in pazienti con miopatie nemaliniche e controlli. D. Fibre muscolari scheletriche di pazienti con miopatie nemaliniche e controlli proiettate su un grafico PCA determinato dalle 1000 fibre analizzate nella Figura 2. Ad esempio, grafici a vulcano che confrontano le differenze tra partecipanti con miopatie nemaliniche ACTA1 e TNNT1 e controlli, e tra partecipanti con miopatie nemaliniche ACTA1 e TNNT1. I cerchi colorati indicano le proteine che presentavano differenze significative a π < 0,05, mentre i punti scuri indicano le proteine che presentavano differenze significative a FDR < 0,05. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il metodo del modello lineare di Limma e metodi bayesiani empirici, seguiti dalla correzione del valore p per confronti multipli utilizzando il metodo di Benjamini-Hochberg. H. Analisi di arricchimento delle proteine significativamente espresse in modo differenziale nell'intero proteoma e nelle fibre di tipo 1 e 2A. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il pacchetto clusterProfiler e valori p corretti con il metodo di Benjamini-Hochberg. I, J. Grafici dell'analisi delle componenti principali (PCA) colorati in base alla matrice extracellulare e ai termini di ontologia genica mitocondriale (GO).
Poiché le miopatie nemaliniche possono influenzare la proporzione di miofibre che esprimono MYH nel muscolo scheletrico,19,20 abbiamo prima esaminato le miofibre che esprimono MYH in pazienti con miopatie nemaliniche e controlli. Abbiamo determinato il tipo di miofibra utilizzando un metodo imparziale precedentemente descritto per il test di 1000 miofibre (Figure supplementari 10D-E) e non siamo riusciti a identificare nuovamente miofibre 2X pure (Figura 6B). Abbiamo osservato un effetto eterogeneo delle miopatie nemaliniche sul tipo di miofibra, poiché due pazienti con mutazioni ACTA1 avevano una proporzione aumentata di miofibre di tipo 1, mentre due pazienti con miopatia nemalinica TNNT1 avevano una proporzione diminuita di miofibre di tipo 1 (Figura 6B). In effetti, l'espressione di MYH2 e delle isoforme della troponina veloce (TNNC2, TNNI2 e TNNT3) era diminuita nelle miopatie nemaliniche ACTA1, mentre l'espressione di MYH7 era diminuita nelle miopatie nemaliniche TNNT1 (Figura supplementare 11A). Ciò è coerente con precedenti segnalazioni di un'eterogenea transizione del tipo di miofibra nelle miopatie nemaliniche.19,20 Abbiamo confermato questi risultati mediante immunoistochimica e abbiamo scoperto che i pazienti con miopatia nemalinica ACTA1 presentavano una predominanza di miofibre di tipo 1, mentre i pazienti con miopatia nemalinica TNNT1 presentavano il modello opposto (Figura 6A).
A livello del proteoma di singola fibra, le fibre muscolari scheletriche dei pazienti affetti da miopatia nemalinica ACTA1 e TNNT1 si sono raggruppate con la maggior parte delle fibre di controllo, con le fibre dei pazienti affetti da miopatia nemalinica TNNT1 generalmente le più gravemente colpite (Figura 6C). Ciò è risultato particolarmente evidente tracciando i grafici dell'analisi delle componenti principali (PCA) delle fibre pseudo-gonfiate per ciascun paziente, con i pazienti 2 e 3 affetti da miopatia nemalinica TNNT1 che apparivano i più distanti dai campioni di controllo (Figura supplementare 11B, Set di dati supplementari 20). Per comprendere meglio come le fibre dei pazienti affetti da miopatia si confrontino con le fibre sane, abbiamo utilizzato informazioni dettagliate ottenute dall'analisi proteomica di 1.000 fibre di partecipanti adulti sani. Abbiamo proiettato le fibre del set di dati sulla miopatia (pazienti affetti da miopatia nemalinica ACTA1 e TNNT1 e controlli) sul grafico PCA ottenuto dall'analisi proteomica di 1.000 fibre (Figura 6D). La distribuzione dei tipi di fibre MYH lungo PC2 nelle fibre di controllo era simile alla distribuzione delle fibre ottenuta dall'analisi proteomica di 1000 fibre. Tuttavia, la maggior parte delle fibre nei pazienti con miopatia nemalinica si è spostata verso il basso lungo PC2, sovrapponendosi alle fibre a contrazione rapida sane, indipendentemente dal loro tipo di fibra MYH nativo. Pertanto, sebbene i pazienti con miopatia nemalinica ACTA1 abbiano mostrato uno spostamento verso le fibre di tipo 1 quando quantificati utilizzando metodi basati su MYH, sia la miopatia nemalinica ACTA1 che la miopatia nemalinica TNNT1 hanno spostato il proteoma delle fibre muscolari scheletriche verso le fibre a contrazione rapida.
Abbiamo quindi confrontato direttamente ciascun gruppo di pazienti con controlli sani e identificato 256 e 552 proteine espresse in modo differenziale rispettivamente nelle miopatie nemaliniche ACTA1 e TNNT1 (Figura 6E-G e Figura supplementare 11C, Set di dati supplementari 21). L'analisi di arricchimento genico ha rivelato una diminuzione coordinata delle proteine mitocondriali (Figura 6H-I, Set di dati supplementari 22). Sorprendentemente, nonostante la predominanza differenziale dei tipi di fibre nelle miopatie nemaliniche ACTA1 e TNNT1, questa diminuzione era completamente indipendente dal tipo di fibra basato su MYH (Figura 6H e Figure supplementari 11D-I, Set di dati supplementari 23). Tre proteine microbiche erano anche regolate nelle miopatie nemaliniche ACTA1 o TNNT1. Due di queste microproteine, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (nota anche come LINC00598 o Lnc-FOXO1) e ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), hanno mostrato un'abbondanza differenziale solo nelle miofibre di tipo 1. È stato precedentemente riportato che ENSG00000215483_TR14_ORF67 svolge un ruolo nella regolazione del ciclo cellulare. 56 D'altra parte, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (corrispondente a LINC01798) è risultata aumentata sia nelle miofibre di tipo 1 che di tipo 2A nella miopatia ACTA1-nemalinica rispetto ai controlli sani (Figura supplementare 12A, Set di dati supplementari 24). Al contrario, le proteine ribosomiali non sono state sostanzialmente influenzate dalla miopatia nemalinica, sebbene RPS17 sia risultata sottoregolata nella miopatia nemalinica ACTA1 (Fig. 6E).
L'analisi di arricchimento ha inoltre rivelato una sovraregolazione dei processi del sistema immunitario nelle miopatie nemaliniche ACTA1 e TNNT1, mentre l'adesione cellulare è risultata aumentata anche nella miopatia nemalinica TNNT1 (Figura 6H). L'arricchimento di questi fattori extracellulari si è riflesso nello spostamento delle proteine della matrice extracellulare in PC1 e PC2 in direzione negativa (ovvero, verso le fibre più colpite) (Figura 6J). Entrambi i gruppi di pazienti hanno mostrato un'espressione aumentata di proteine extracellulari coinvolte nelle risposte immunitarie e nei meccanismi di riparazione del sarcolemma, come le annessine (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 e la loro proteina interagente S100A1159 (Figure supplementari 12B-C). È stato precedentemente riportato che questo processo è potenziato nelle distrofie muscolari60 ma, a nostra conoscenza, non è stato precedentemente associato alle miopatie nemaliniche. Il normale funzionamento di questo macchinario molecolare è necessario per la riparazione del sarcolemma in seguito a lesioni e per la fusione dei miociti neoformati con le miofibre58,61. Pertanto, l'aumentata attività di questo processo in entrambi i gruppi di pazienti suggerisce una risposta riparativa alla lesione causata dall'instabilità delle miofibre.
Gli effetti di ciascuna miopatia nemalinica erano ben correlati (r = 0,736) e mostravano una ragionevole sovrapposizione (Figure supplementari 11A-B), indicando che le miopatie nemaliniche ACTA1 e TNNT1 hanno effetti simili sul proteoma. Tuttavia, alcune proteine erano regolate solo nelle miopatie nemaliniche ACTA1 o TNNT1 (Figure supplementari 11A e C). La proteina profibrotica MFAP4 era una delle proteine maggiormente sovraregolate nella miopatia nemalinica TNNT1, ma rimaneva invariata nella miopatia nemalinica ACTA1. SKIC8, un componente del complesso PAF1C responsabile della regolazione della trascrizione dei geni HOX, era sottoregolato nella miopatia nemalinica TNNT1, ma non influenzato nella miopatia nemalinica ACTA1 (Figura supplementare 11A). Il confronto diretto tra la miopatia nemalinica ACTA1 e quella TNNT1 ha rivelato maggiori riduzioni delle proteine mitocondriali e aumenti delle proteine del sistema immunitario nella miopatia nemalinica TNNT1 (Figura 6G-H e Figure supplementari 11C e 11H-I). Questi dati sono coerenti con la maggiore atrofia/distrofia osservata nella miopatia nemalinica TNNT1 rispetto alla miopatia nemalinica TNNT1 (Figura 6A), suggerendo che la miopatia nemalinica TNNT1 rappresenti una forma più grave della malattia.
Per valutare se gli effetti osservati della miopatia nemalinica persistono a livello dell'intero muscolo, abbiamo eseguito un'analisi proteomica di massa di biopsie muscolari provenienti dalla stessa coorte di pazienti con miopatia nemalinica TNNT1 e le abbiamo confrontate con i controlli (n=3 per gruppo) (Figura supplementare 13A, Set di dati supplementari 25). Come previsto, i controlli erano strettamente correlati nell'analisi delle componenti principali, mentre i pazienti con miopatia nemalinica TNNT1 mostravano una maggiore variabilità intercampione, simile a quella osservata nell'analisi delle singole fibre (Figura supplementare 13B). L'analisi di massa ha riprodotto le proteine espresse in modo differenziale (Figura supplementare 13C, Set di dati supplementari 26) e i processi biologici (Figura supplementare 13D, Set di dati supplementari 27) evidenziati dal confronto delle singole fibre, ma ha perso la capacità di distinguere tra diversi tipi di fibre e non è riuscita a tenere conto degli effetti eterogenei della malattia tra le fibre.
Nel loro insieme, questi dati dimostrano che la proteomica delle singole miofibre può chiarire caratteristiche biologiche cliniche non rilevabili con metodi mirati come l'immunoblotting. Inoltre, questi dati evidenziano i limiti dell'utilizzo della sola tipizzazione delle fibre di actina (MYH) per descrivere l'adattamento fenotipico. Infatti, sebbene il passaggio tra i tipi di fibre differisca tra le miopatie nemaliniche da actina e da troponina, entrambe le miopatie nemaliniche disaccoppiano la tipizzazione delle fibre MYH dal metabolismo delle fibre muscolari scheletriche, orientandolo verso un proteoma muscolare più veloce e meno ossidativo.
L'eterogeneità cellulare è fondamentale affinché i tessuti possano soddisfare le loro diverse esigenze. Nel muscolo scheletrico, questa eterogeneità viene spesso descritta come la presenza di tipi di fibre caratterizzati da diversi gradi di produzione di forza e affaticabilità. Tuttavia, è chiaro che ciò spiega solo una piccola parte della variabilità delle fibre muscolari scheletriche, che è molto più variabile, complessa e sfaccettata di quanto si pensasse in precedenza. I progressi tecnologici hanno ora fatto luce sui fattori che regolano le fibre muscolari scheletriche. Infatti, i nostri dati suggeriscono che le fibre di tipo 2X potrebbero non rappresentare un sottotipo distinto di fibre muscolari scheletriche. Inoltre, abbiamo identificato proteine metaboliche, proteine ribosomiali e proteine associate alla cellula come principali determinanti dell'eterogeneità delle fibre muscolari scheletriche. Applicando il nostro flusso di lavoro proteomico a campioni di pazienti affetti da miopatia da nematodi, abbiamo ulteriormente dimostrato che la tipizzazione delle fibre basata su MYH non riflette completamente l'eterogeneità del muscolo scheletrico, soprattutto quando il sistema è alterato. In effetti, a prescindere dal tipo di fibra muscolare basata su MYH, la miopatia da nematodi determina uno spostamento verso fibre muscolari più veloci e meno ossidative.
Le fibre muscolari scheletriche sono state classificate fin dal XIX secolo. Recenti analisi omiche ci hanno permesso di iniziare a comprendere i profili di espressione dei diversi tipi di fibre MYH e le loro risposte a diversi stimoli. Come descritto in questo studio, gli approcci omici presentano anche il vantaggio di una maggiore sensibilità nella quantificazione dei marcatori del tipo di fibra rispetto ai metodi tradizionali basati sugli anticorpi, senza dover fare affidamento sulla quantificazione di un singolo (o pochi) marcatori per definire un tipo di fibra muscolare scheletrica. Abbiamo utilizzato flussi di lavoro trascrittomici e proteomici complementari e integrato i risultati per esaminare la regolazione trascrizionale e post-trascrizionale dell'eterogeneità delle fibre nelle fibre muscolari scheletriche umane. Questo flusso di lavoro non ha permesso di identificare fibre di tipo 2X pure a livello proteico nel vasto laterale della nostra coorte di giovani uomini sani. Ciò è coerente con precedenti studi su singole fibre che hanno riscontrato meno dell'1% di fibre 2X pure nel vasto laterale sano, sebbene questo dato debba essere confermato in altri muscoli in futuro. La discrepanza tra il rilevamento di fibre 2X quasi pure a livello di mRNA e solo fibre miste 2A/2X a livello proteico è sconcertante. L'espressione dell'mRNA dell'isoforma MYH non è circadiana,67 il che suggerisce che è improbabile che abbiamo "perso" il segnale di inizio di MYH2 in fibre 2X apparentemente pure a livello di RNA. Una possibile spiegazione, sebbene puramente ipotetica, potrebbe essere rappresentata da differenze nella stabilità delle proteine e/o dell'mRNA tra le isoforme di MYH. In effetti, nessuna fibra veloce è pura al 100% per nessuna isoforma di MYH, e non è chiaro se livelli di espressione dell'mRNA di MYH1 nell'intervallo 70-90% si tradurrebbero in un'abbondanza uguale di MYH1 e MYH2 a livello proteico. Tuttavia, considerando l'intero trascrittoma o proteoma, l'analisi dei cluster può identificare con sicurezza solo due cluster distinti che rappresentano le fibre muscolari scheletriche lente e veloci, indipendentemente dalla loro precisa composizione di MYH. Ciò è coerente con le analisi che utilizzano approcci trascrittomici a singolo nucleo, che in genere identificano solo due distinti cluster mionucleari. 68, 69, 70 Inoltre, sebbene precedenti studi proteomici abbiano identificato fibre di tipo 2X, queste fibre non si raggruppano separatamente dal resto delle fibre veloci e mostrano solo un piccolo numero di proteine differenzialmente abbondanti rispetto ad altri tipi di fibre basati su MYH. 14 Questi risultati suggeriscono che dovremmo tornare alla visione di inizio XX secolo della classificazione delle fibre muscolari, che divideva le fibre muscolari scheletriche umane non in tre classi distinte basate su MYH, ma in due cluster basati sulle loro proprietà metaboliche e contrattili. 63
Ancora più importante, l'eterogeneità delle miofibre dovrebbe essere considerata lungo molteplici dimensioni. Precedenti studi "omici" hanno indicato questa direzione, suggerendo che le fibre muscolari scheletriche non formano cluster discreti ma sono disposte lungo un continuum. 11, 13, 14, 64, 71 Qui, mostriamo che, oltre alle differenze nelle proprietà contrattili e metaboliche del muscolo scheletrico, le miofibre possono essere differenziate da caratteristiche correlate alle interazioni cellula-cellula e ai meccanismi di traduzione. Infatti, abbiamo trovato eterogeneità ribosomiale nelle fibre muscolari scheletriche che contribuisce all'eterogeneità indipendentemente dai tipi di fibre lente e veloci. La causa sottostante di questa sostanziale eterogeneità delle miofibre, indipendentemente dal tipo di fibra lenta o veloce, rimane poco chiara, ma potrebbe indicare un'organizzazione spaziale specializzata all'interno dei fascicoli muscolari che rispondono in modo ottimale a forze e carichi specifici,72 una comunicazione cellulare specializzata o organo-specifica con altri tipi cellulari nel microambiente muscolare73,74,75 o differenze nell'attività ribosomiale all'interno delle singole miofibre. Infatti, è stato dimostrato che l'eteroplasmia ribosomiale, sia attraverso la sostituzione paraloga di RPL3 e RPL3L sia a livello della 2'O-metilazione dell'rRNA, è associata all'ipertrofia del muscolo scheletrico76,77. Applicazioni multi-omiche e spaziali, combinate con la caratterizzazione funzionale delle singole miofibre, faranno ulteriormente progredire la nostra comprensione della biologia muscolare a livello multi-omico78.
Analizzando i proteomi di singole miofibre di pazienti affetti da miopatie nemaliniche, abbiamo anche dimostrato l'utilità, l'efficacia e l'applicabilità della proteomica delle singole miofibre per chiarire la fisiopatologia clinica del muscolo scheletrico. Inoltre, confrontando il nostro flusso di lavoro con l'analisi proteomica globale, siamo stati in grado di dimostrare che la proteomica delle singole miofibre fornisce la stessa profondità di informazioni della proteomica tissutale globale e ne estende la profondità tenendo conto dell'eterogeneità interfibra e del tipo di miofibra. Oltre alle differenze attese (seppur variabili) nel rapporto tra i tipi di fibre osservate nelle miopatie nemaliniche ACTA1 e TNNT1 rispetto ai controlli sani,19 abbiamo anche osservato un rimodellamento ossidativo ed extracellulare indipendente dal cambiamento del tipo di fibra mediato da MYH. La fibrosi è stata precedentemente segnalata nelle miopatie nemaliniche TNNT1.19 Tuttavia, la nostra analisi si basa su questa scoperta rivelando anche livelli aumentati di proteine extracellulari secrete correlate allo stress, come le annessine, coinvolte nei meccanismi di riparazione del sarcolemma, nelle miofibre di pazienti con miopatie nemaliniche ACTA1 e TNNT1.57,58,59 In conclusione, l'aumento dei livelli di annessina nelle miofibre di pazienti con miopatia nemalinica potrebbe rappresentare una risposta cellulare per riparare le miofibre gravemente atrofiche.
Sebbene questo studio rappresenti la più ampia analisi omica di singole fibre muscolari su interi soggetti umani condotta fino ad oggi, presenta comunque dei limiti. Abbiamo isolato fibre muscolari scheletriche da un campione di partecipanti relativamente piccolo e omogeneo e da un singolo muscolo (il vasto laterale). Pertanto, è impossibile escludere l'esistenza di specifiche popolazioni di fibre in diversi tipi di muscolo e in condizioni fisiologiche muscolari estreme. Ad esempio, non possiamo escludere la possibilità che un sottoinsieme di fibre ultraveloci (ad esempio, fibre 2X pure) emerga in velocisti e/o atleti di forza altamente allenati79 o durante periodi di inattività muscolare66,80. Inoltre, le dimensioni limitate del campione di partecipanti ci hanno impedito di indagare le differenze di genere nell'eterogeneità delle fibre, poiché è noto che i rapporti tra i tipi di fibre differiscono tra uomini e donne. Infine, non siamo stati in grado di condurre analisi trascrittomiche e proteomiche sulle stesse fibre muscolari o su campioni provenienti dagli stessi partecipanti. Mentre noi e altri continuiamo a ottimizzare le analisi di singole cellule e singole miofibre utilizzando l'analisi omica per ottenere un input di campione estremamente ridotto (come dimostrato qui nell'analisi delle fibre di pazienti con miopatia mitocondriale), diventa evidente l'opportunità di combinare approcci multi-omici (e funzionali) all'interno di singole fibre muscolari.
Nel complesso, i nostri dati identificano e spiegano i fattori trascrizionali e post-trascrizionali che determinano l'eterogeneità del muscolo scheletrico. In particolare, presentiamo dati che mettono in discussione un dogma consolidato nella fisiologia del muscolo scheletrico, associato alla classica definizione dei tipi di fibre basata sul gene MYH. Ci auguriamo di rilanciare il dibattito e, in definitiva, di ripensare la nostra comprensione della classificazione e dell'eterogeneità delle fibre muscolari scheletriche.
Quattordici partecipanti caucasici (12 uomini e 2 donne) hanno volontariamente accettato di partecipare a questo studio. Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Universitario di Gand (BC-10237), è conforme alla Dichiarazione di Helsinki del 2013 ed è stato registrato su ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Le caratteristiche generali dei partecipanti sono presentate nella Tabella supplementare 1. Dopo aver ottenuto il consenso informato verbale e scritto, i partecipanti sono stati sottoposti a una visita medica prima dell'inclusione definitiva nello studio. I partecipanti erano giovani (22-42 anni), sani (nessuna condizione medica, nessuna storia di fumo) e moderatamente attivi fisicamente. Il consumo massimo di ossigeno è stato determinato utilizzando un ergometro a gradini per valutare la forma fisica come descritto in precedenza. 81
Campioni di biopsia muscolare sono stati raccolti a riposo e a digiuno tre volte, a distanza di 14 giorni l'una dall'altra. Poiché questi campioni sono stati raccolti nell'ambito di uno studio più ampio, i partecipanti hanno assunto un placebo (lattosio), un antagonista del recettore H1 (540 mg di fexofenadina) o un antagonista del recettore H2 (40 mg di famotidina) 40 minuti prima della biopsia. Abbiamo precedentemente dimostrato che questi antagonisti dei recettori dell'istamina non influenzano la forma fisica del muscolo scheletrico a riposo81 e non è stato osservato alcun raggruppamento correlato allo stato nei nostri grafici di controllo qualità (Figure supplementari 3 e 6). Una dieta standardizzata (41,4 kcal/kg di peso corporeo, 5,1 g/kg di peso corporeo di carboidrati, 1,4 g/kg di peso corporeo di proteine e 1,6 g/kg di peso corporeo di grassi) è stata mantenuta per 48 ore prima di ogni giorno sperimentale e una colazione standardizzata (1,5 g/kg di peso corporeo di carboidrati) è stata consumata la mattina del giorno sperimentale. In anestesia locale (0,5 ml di lidocaina all'1% senza epinefrina), sono state prelevate biopsie muscolari dal muscolo vasto laterale mediante aspirazione percutanea di Bergström.82 I campioni muscolari sono stati immediatamente inclusi in RNAlater e conservati a 4°C fino alla dissezione manuale delle fibre (fino a 3 giorni).
I fasci di miofibre appena isolati sono stati trasferiti in un nuovo terreno di coltura RNAlater in una piastra. Le singole miofibre sono state quindi dissezionate manualmente utilizzando uno stereomicroscopio e delle pinzette sottili. Da ogni biopsia sono state dissezionate venticinque fibre, prestando particolare attenzione alla selezione di fibre provenienti da diverse aree della biopsia. Dopo la dissezione, ogni fibra è stata delicatamente immersa in 3 μl di tampone di lisi (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) contenente enzimi proteinasi K e DNasi per rimuovere proteine e DNA indesiderati. La lisi cellulare e la rimozione di proteine/DNA sono state quindi avviate mediante una breve agitazione al vortex, centrifugazione del liquido in una microcentrifuga e incubazione a temperatura ambiente (10 min). Il lisato è stato quindi incubato in un termociclatore (T100, Bio-Rad) a 37 °C per 5 min, 75 °C per 5 min e quindi immediatamente conservato a -80 °C fino all'ulteriore elaborazione.
Le librerie di RNA poliadenilato compatibili con Illumina sono state preparate a partire da 2 µl di lisato di miofibre utilizzando il kit QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). I metodi dettagliati sono reperibili nel manuale del produttore. Il processo inizia con la sintesi del cDNA di primo filamento mediante trascrizione inversa, durante la quale vengono introdotti identificatori molecolari univoci (UMI) e codici a barre i1 specifici per ciascun campione, al fine di garantire il pooling dei campioni e ridurre la variabilità tecnica durante le fasi successive di elaborazione. Il cDNA proveniente da 96 miofibre viene quindi unito e purificato con microsfere magnetiche, dopodiché l'RNA viene rimosso e viene eseguita la sintesi del secondo filamento utilizzando primer casuali. La libreria viene purificata con microsfere magnetiche, vengono aggiunti tag i5/i7 specifici per ciascun pool e amplificata tramite PCR. Una fase finale di purificazione produce librerie compatibili con Illumina. La qualità di ciascun pool di librerie è stata valutata utilizzando il kit High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
In base alla quantificazione con Qubit, i pool sono stati ulteriormente uniti a concentrazioni equimolari (2 nM). Il pool risultante è stato quindi sequenziato su uno strumento NovaSeq 6000 in modalità standard utilizzando il kit di reagenti NovaSeq S2 (1 × 100 nucleotidi) con un caricamento di 2 nM (4% PhiX).
La nostra pipeline si basa sulla pipeline di analisi dati QuantSeq Pool di Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). I dati sono stati inizialmente demultiplexati con bcl2fastq2 (v2.20.0) in base all'indice i7/i5. La lettura 2 è stata quindi demultiplexata con idemux (v0.1.6) in base al codice a barre del campione i1 e le sequenze UMI sono state estratte con umi_tools (v1.0.1). Le letture sono state poi rifilate con cutadapt (v3.4) in più cicli per rimuovere le letture corte (<20 di lunghezza) o le letture costituite esclusivamente da sequenze adattatrici. Le letture sono state quindi allineate al genoma umano utilizzando STAR (v2.6.0c) e i file BAM sono stati indicizzati con SAMtools (v1.11). Le letture duplicate sono state rimosse utilizzando umi_tools (v1.0.1). Infine, il conteggio degli allineamenti è stato eseguito utilizzando featureCounts in Subread (v2.0.3). Il controllo di qualità è stato effettuato utilizzando FastQC (v0.11.9) in diverse fasi intermedie della pipeline.
Tutte le successive elaborazioni e visualizzazioni bioinformatiche sono state eseguite in R (v4.2.3), principalmente utilizzando il flusso di lavoro Seurat (v4.4.0). 83 Pertanto, i singoli valori UMI e le matrici di metadati sono stati trasformati in oggetti Seurat. I geni espressi in meno del 30% di tutte le fibre sono stati rimossi. I campioni di bassa qualità sono stati rimossi in base a una soglia minima di 1000 valori UMI e 1000 geni rilevati. In definitiva, 925 fibre hanno superato tutte le fasi di filtraggio del controllo qualità. I valori UMI sono stati normalizzati utilizzando il metodo Seurat SCTransform v2, 84 includendo tutte le 7418 caratteristiche rilevate, e le differenze tra i partecipanti sono state eliminate tramite regressione. Tutti i metadati rilevanti sono disponibili nel Dataset supplementare 28.
Data di pubblicazione: 10 settembre 2025